生物防治-06转基因抗虫植物.docVIP

转基因抗虫植物 按美国的情况，该章应为植物农药 国务院于2001年5月颁布了《转基因生物安全管理条例》 农业转基因生物是指利用基因工程技术改变基因组构成，用于农业生产或者农产品加工的动植物、微生物及其产品，主要包括：　　(一)转基因动植物（含种子、种畜禽、水产苗种）和微生物；　 （二）转基因动植物、微生物产品；　 （三）转基因农产品的直接加工品；　 （四）含有转基因动植物、微生物或者其产品成份的种子、种畜禽、水产苗种、农药、兽药、肥料和添加剂等产品。虫害是制约农作物高产的重要因素，世界每年因虫害造成的损失约占农作物总产量的15%以上。化学农药的施用在减少虫害的同时引起一系列副作用，如提高成本、污染环境、诱导害虫产生抗药性、引起次要害虫的大发生等。通过基因工程手段培育抗虫新品种 (系)可从根本上解决问题，对哺乳动物和一些有益昆虫不产生毒害作用，且不造成环境污染，具有广阔的应用前景。目前全世界最常改良的性状中抗虫占第二位(24%)，到1998年已商业化的6类性状中抗虫占15%。人们已从细菌中、植物本身以及昆虫体内发现并分离到许多抗虫基因，有许多抗虫转基因植物正在进行田间试验，并有一些品种已商品化。迄今发现并应用于提高植物抗虫性的基因主要有两类:一类是从细菌中分离出来的抗虫基因，如苏云金杆菌毒蛋白基因(Bt基因)、异戊基转移酶基因(ipt)，另一类是从植物中分离出来的抗虫基因，如蛋白酶抑制剂基因(PI基因)、淀粉酶抑制剂基因、外源凝集素基因等。其中Bt基因和PI基因在农业上利用最广 Bt杀虫晶体蛋白（Bt毒蛋白Bt杀虫晶体蛋白ICP是单基因直接表达的产物，不同基因型所表达的产物具有显著不同的杀虫特异性。自1981年Schnepf等克隆了苏云金芽孢杆菌的第一个ICP基因,并于1985年发表了它的DNA碱基序列及其编码蛋白的氨基酸序列起,迄今已发现和克隆了170多种ICP基因。因此，弄清ICP基因型，对于菌株鉴定及筛选、杀虫特性的了解、杀虫谱的改良等，都具有重要意义。90年代以来，聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术以其快速、简便、灵敏的特点在Bt ICP基因的鉴定上得到了广泛应用。本文就Bt ICP基因PCR鉴定的策略进行探讨，并对其进展作一回顾。1.Bt毒蛋白的杀虫机理Bt是苏云金杆菌Baciius thuringiensis的简称，是一种革兰氏阳性土壤芽胞杆菌。通过克隆技术确定Bt基因位于30~150MD大小不同的质粒上，其中毒性区间位于该序列N端29~607个编码区，C端有高度的保守性，对稳定晶体蛋白结构可能起着重要作用。Bt杀虫活性源于芽胞形成时产生的杀虫结晶蛋白(insecticidal crystal protein，ICP)或苏云金杆菌毒蛋白(Bt toxic protein)，其中应用于农业生产的主要是δ内毒素。已知δ内毒素为130~160KD的多肽，在伴孢晶体内是以原毒素(protoxin)的形式存在，经体外碱解或在昆虫肠道内被蛋白酶水解成55~70KD或更小的多肽，与敏感昆虫中肠道上皮纹缘细胞 (brushborder membrance)上的特异受体位点结合，引起并破坏纹缘膜细胞渗透压平衡，使细胞裂解，杀死昆虫。2.Bt霉蛋白基因分类自1901年发现苏云金杆菌以来，现已分离出4万多个Bt菌种，报道了51个血清型，50多个亚种，已克隆出60多个毒素基因。不同基因型杀虫谱不同，毒蛋白的大小及形状也不一样。根据杀虫谱的不同，将杀虫基因分成六大类，统称为cry基因，用罗马数字I、II、III、IV等来命名，分别代表几种杀虫范围。在每一类型下根据氨基酸序列的同源性，又分为A，B，C等不同的基因型。在同一基因型下根据限制性内切酶的酶谱和分子量的大小，又分为a，b，c等不同的基因亚型。其分类如下:cry I基因型编码对鳞翅目昆虫有毒杀作用的菱形伴孢晶体蛋白，约30~140KD，在昆虫中肠内降解为60~70KD的多肽，在cry I基因间，氨基酸同源性为82%~90%的归为cry I A;55%~71%的归为cry I A基因中，根据限制性内切酶的酶谱和分子量的大小，又分为:cry I A (a)，4.50kb; cry I A (b)，5.30kb; cry I A (c)，6.60kb亚类基因。Cry II基因通常编码对鳞翅目和双翅目昆虫有毒杀作用的立方体伴孢晶体蛋白，约65KD。而cry II B只对鳞翅目昆虫有毒性，它们之间的同源性达80%左右。cry III基因编码对鞘翅目昆虫有特异毒杀作用的长方形伴孢晶体，约72KD。Cry III A基因与cry I和cryIV基因的毒性核心5 端编码区有同源性，与3端编码区有所不同，如果将3端去掉，将失去杀虫活性。Cry I