鼠单抗的改造.pptVIP

鼠单抗的改造 本章主要内容 概述 C区的人源化--嵌合抗体 V区的人源化--改型抗体 小分子抗体 概述 鼠源性单抗在临床应用中存在的问题 具免疫原性 激发免疫应答，消弱疗效，产生副作用 与FC片段相关的功能不能有效活化 如活化补体，ADCC,调理作用 半衰期短 概述 鼠源性单抗的改造原则 保持原来抗体的特异性与亲和力； 尽量减小其免疫原性。 发展阶段 C区的人源化--嵌合抗体 鼠抗V区与人抗C区组装而成 V区的人源化 改型抗体 小分子抗体 C区的人源化--嵌合抗体 1984 Morrison首次报道 依据 90%的人抗鼠抗体反应针对鼠抗C区 基本手段 从杂交瘤中获得鼠抗V区基因 从人B细胞获得人抗C区基因 将二者克隆到表达载体 转染哺乳动物细胞，进行表达 C区的人源化--嵌合抗体 主要形式 嵌合IgG 嵌合Fab 嵌合F(ab’)2 C区的人源化--嵌合抗体 嵌合IgG 目前构建的大多数嵌合抗体均为鼠-人IgG 如何构建？ C区的人源化--嵌合抗体 嵌合IgG 目前构建的大多数嵌合抗体均为鼠-人IgG 抗体基因的克隆 鼠抗V区基因的获得 RT-PCR方法 引物设计：依据VH和VL的组成--由4个相对保守的FR和3个CDR，设计（注意酶切位点）。 C区的人源化--嵌合抗体 嵌合IgG 目前构建的大多数嵌合抗体均为鼠-人IgG 抗体基因的克隆 鼠抗V区基因的获得 提取mRNA：从杂交瘤或脾细胞中获得 RT-PCR法克隆VH和VL基因 C区的人源化--嵌合抗体 嵌合IgG 目前构建的大多数嵌合抗体均为鼠-人IgG 抗体基因的克隆 人抗C区基因的获得 C区的选择：依据目的不同选择C区—即抗体亚型，如补体活化能力， ADCC等 IgG1的补体活化及ADCC作用强于 IgG3，而IgG4没有或很弱。 与Fc受体结合力IgG1和IgG3 最强 IgG1和 IgG4半衰期较长 C区的人源化--嵌合抗体 嵌合IgG 目前构建的大多数嵌合抗体均为鼠-人IgG 抗体基因的克隆 人抗C区基因的获得 引物设计：C区基因，设计时注意酶切位点 提取mRNA：从B细胞中获得 RT-PCR法克隆C区基因 C区的人源化--嵌合抗体 嵌合IgG 目前构建的大多数嵌合抗体均为鼠-人IgG 表达载体的构建 构建嵌合L链与H链的重组质粒 注意必须是真核表达载体 C区的人源化--嵌合抗体 嵌合IgG 目前构建的大多数嵌合抗体均为鼠-人IgG 嵌合抗体的表达 转染哺乳动物细胞进行表达 哺乳动物细胞的选择：骨髓瘤细胞，COS细胞，CHO细胞等。 几种常用宿主细胞的表达特点 COS细胞 短暂表达较为理想，几天内即可装配成功 骨髓瘤细胞 最主要的宿主细胞，如NS0 CHO细胞 常用宿主细胞，300-900mg/L 嵌合IgG优点与不足 优点 保留了鼠抗的特异性与亲和力 基本解决鼠抗免疫原性所致的不良反应 能有效激活补体及ADCC 延长半衰期 改善药代动力学特性 嵌合IgG优点与不足 不足 仍具一定抗原性 分子量较大，组织穿透能力较差 清除较慢 在导向诊断与治疗方面受限 C区的人源化--嵌合抗体 Fab和F(ab’)2嵌合抗体 Fab 克隆鼠抗V区基因 克隆人抗CH1和Cκ基因 重组 构建表达载体 转染宿主细胞，表达嵌合抗体 C区的人源化--嵌合抗体 Fab和F(ab’)2嵌合抗体 F(ab’)2 化学偶联法 通过化学试剂将Fab连接成一个双价抗体分子 重组末端修饰法 在Fab的C端额外连接一个Cys残基：效率较低 连接（CPP）3，效率可达70% C区的人源化--嵌合抗体 Fab和F(ab’)2嵌合抗体 优点 可原核表达 包涵体 ：高效，可达30%，复性难 分泌表达：周质腔，可溶有活性，避免降解，降低毒性 成功范例：抗CD3的Fab 700mg/L 人源化抗体HuMab4125-8 Fab’ 2g/L C区的人源化--嵌合抗体 Fab和F(ab’)2嵌合抗体 优点 可原核表达 良好的药物载体 血液清除率高 导向诊断与治疗 C区的人源化--嵌合抗体 Fab和F(ab’)2嵌合抗体 缺点 无ADCC,CDC 滞留时间短 仍具一定抗原性 V区的人源化 嵌合抗体不能完全解决抗原性问题 V区的人源化—将鼠抗CDR移植到人抗V区中的FR区。 构建策略 CDR移植抗体 最为普遍