有限的内切核酸酶知识.pptVIP

限制性核酸内切酶;简介;定义和命名;特征和种类; 2.限制与修饰系统的种类　　根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统主要分成三大类。表 2-1 是各种限制与修饰系统的比较。　　Ⅱ 型（type Ⅱ）限制与修饰系统所占的比例最大，达 93% 。Ⅱ型酶相对来说最简单，它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割 DNA ，产生带 3- 羟基和 5- 磷酸基团的 DNA 产物，需 Mg2+ 的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需 SAM 。识别序列主要为 4-6bp ，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列，切割位置因酶而异，有些是隔开的。　　Ⅱs 型（type Ⅱs）限制与修饰系统，占 5% ，与 Ⅱ 型具有相似的辅因子要求，但识别位点是非对称，也是非间断的，长度为 4-7bp ，切割位点可能在识别位点一侧的 20bp 范围内。　　Ⅱ 型限制酶一般是同源二聚体（homodimer），由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位作用在 DNA 链的两个互补位点上。修饰酶是单体，修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成，分别作用于其中一条链，但甲基化的碱基在两条链上是不同的。　　在 Ⅱ 型限制酶中还有一类特殊的类型，该酶只切割双链 DNA 中的一条链，造成一个切口，这类限制酶也称切口酶 （nicking enzyme），如 N.Bst NBI 。; Ⅰ 型（type Ⅰ）限制与修饰系统的种类很少，只占 1% ，能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。如 EcoK 和 EcoB。其限制酶和甲基化酶 （即 R 亚基和 M 亚基） 各作为一个亚基存在于酶分子中，另外还有负责识别 DNA 序列的 S 亚基，分别由 hsdR、hsdM 和 hsdS 基因编码，属于同一操纵子（转录单位）。EcoK 编码基因的结构为 R2M2S。 EcoB 编码基因的结构为 R2M4S2 。　　EcoB 酶的识别位点如下，其中两条链中的 A 为甲基化位点， N 表示任意碱基。 　　 TGA*（N）8TGCT 　　EcoK 酶的识别位点如下，其中两条链中的 A 为可能的甲基化位点。　 AA°C（N）6GTGC　　但是 EcoB 酶和 EcoK 酶的切割位点在识别位点 1000bp 以外，且无特异性。　　Ⅲ 型（type Ⅲ）限制与修饰系统的种类更少，所占比例不到 1% ，也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则是任意的，如 EcoP1 和 EcoP15 。它们的识别位点分别是 AGACC 和 CAGCAG ，切割位点则在下游 24-26bp 处。　　在基因操作中，一般所说的限制酶或修饰酶，除非特指，均指 Ⅱ 型系统中的种类。 ;表2-1：各种限制与修饰系统的比较;限制酶识别的序列 ;　2．限制酶识别序列的结构　　限制酶识别的序列大多数为回文对称结构，切割位点在 DNA 两条链相对称的位置。 EcoRⅠ 和 HindⅢ 的识别序列和切割位置如下： 　　EcoRⅠ G↓AATTC；HindⅢ A↓AGCTT　　 CTTAA↑G TTCGA↑A　　有一些限制酶的识别序列不是对称的，如 AccBSⅠ[CCGCTC（-3/-3）] 和 BssSⅠ[CTCGTG（-5/-1）]。识别序列后面括号内的数字表示在两条链上的切割位置。 　　AccBSⅠ CCG↓CTC；BssSⅠ C↓TCGTG　　 GGC↑GAG GAGCA↑C　　有一些限制酶可识别多种序列，如 AccⅠ 识别的序列是 GT↓MKAC ，也就是说可识别 4 种序列，其中两种是对称的，另两种是非对称的。 HindⅡ 识别的序列是 GTY↓RAC 。 　　有一些限制酶识别的序列呈间断对称，对称序列之间含有若干个任意碱基。如 AlwNⅠ 和 DdeⅠ ，它们的识别序列如下：　　AlwNⅠ CAGNNNC↓TG；DdeⅠ C↓TNAG　　 GT↑CNNNGAC GANT↑C ;　3．限制酶切割的位置 　　限制酶对 DNA 的切割位置大多数在内部，但也有在外部的。在外部的，又有两端、两侧和单侧之别。切点在两端的有 Sau3AⅠ（↓GATC）、NlaⅢ（CATG↓）和 EcoRⅡ（↓CCWGG） 等；在两侧的有 BcgⅠ[（10/12）CGA（N）6TGC（12/10）]和 TspRⅠ（CASTGNN↓