丹参功能基因组学研究Ⅱ-中国中药杂志.PDF

第３２卷第１３期 　　　 中国 中药杂 志 Ｖｏｌ．３２，Ｉｓｓｕｅ　１３ ２００７年７月 　　　　　　　　　ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ　　　　　　　 Ｊｕｌｙ，２００７ ·研究论文 · 丹参功能基因组学研究Ⅱ ———丹参毛状根不同时期基因表达谱分析 １ １ ２ １ １ 崔光红 ，黄璐琦 ，邱德有 ，袁　媛 ，付桂芳 （１中国中医科学院 中药研究所，北京 １００７００；２中国林业科学院林业研究所，北京 １０００９１） ［摘要］　目的：研究丹参毛状根不同时期的基因表达谱，发掘丹参功能基因。方法：通过比较不同时期丹参毛 状根的生长量和次生代谢产物含量确定用于ｃＤＮＡ芯片杂交的材料。采用间接标记法进行探针标记后进行杂交 反应，ＧｅｎｅＰｉｘＰｒｏ４０软件对芯片图像进行分析，数据用Ｌｏｗｅｓｓ方法进行归一化处理。采用两倍差异标准结合Ｔ 检验来确定差异表达基因。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ点杂交检验４个基因与芯片杂交结果的一致性。差异基因单向测序后经过 ｇａｐ４软件拼接聚类，然后利用ＢＬＡＳＴＸ，ＢＬＡＳＴＮ进行比对分析，利用ＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙ和ＫＥＧＧ进一步预测基因的功 能。结果：３０～４５ｄ为丹参毛状根的快速增殖期，４５～６０ｄ为丹参次生代谢产物的快速积累期。将４５，６０ｄ丹参毛 状根分别与３０ｄ材料进行杂交，得到２０３个差异基因。４个基因Ｎｏｒｔｈｅｒｎ点杂交的结果与芯片杂交结果一致。测 序后得到１７２条ＥＳＴ，拼接聚类后形成１１４个Ｕｎｉｇｅｎｅ，其中功能已知基因６２个，功能未定的假想蛋白３４个，相似 性较低的未鉴定基因９个，无显著相似性的基因９个。“ＧＯ”分类中６７个基因得到注释，ＫＥＧＧ分析中７４个基因得 到注释，２６个有详细的代谢途径分析。结论：得到一系列次生代谢相关基因如细胞色素Ｐ４５０、二萜合酶等基因片 段，为深入开展丹参功能基因组学研究提供了基础。 ［关键词］　丹参；毛状根；基因表达谱；ｃＤＮＡ芯片 ［中图分类号］Ｓ５６７　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１００１５３０２（２００７）１３１２６７０６ 　　随着植物功能基因组研究的广泛与深入，独具 感染的方式进行Ｒｉ质粒转化诱导的毛状根，由邱德 ［６］ 特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成相 有研究员提供 。取生长良好的丹参毛状根（各 ［１］ 关功能基因的研究逐渐成为研究的热点 。丹参 ０１ｇ）继代培养于６，７Ｖ固体培养基上，置于２５℃ ＳａｌｖｉａｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａＢｇｅ疗效明确，化学成分研究较 培养箱中暗培养，分别于３０，４５，６０ｄ收获，称重，每 为深入，含有类异戊二烯和苯丙烷类两大代谢途 个时间点３次重复。 ［２，３］ 径 ，但仅有３羟基３甲基戊二酰辅酶Ａ还原酶 １２　次生代谢产物分析　将毛状根研碎，取适量粉 （ＨＭＧＲ）和４香豆酸辅酶Ａ连接酶（４ＣＬ）等少量参 末用７０％甲醇回流提取后分别进行高效液相指纹 ［４］ ［７］ 与次生代谢的基因得到克隆 。因此，大规模寻找 图谱分析 ，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系 次生代谢关键酶基因是丹参分子生物学研究的重要 统２００４Ａ版（国家药典委员会）提取不同样品的共 内容。本研究以不同时期丹参毛状根为研究材料， 有峰，所有样品峰面积均小于１００ｍＡＵ，没有得到基 ［５］ 探索已构建丹参ｃＤＮＡ芯片 在其功能基因组学研 线分离的峰不予提取。 究中的可行性，为中药材功能基因组研究提供一套