产自嗜热脂肪芽孢杆菌NCIM-5146的热稳定α-半乳糖苷酶的纯化.DOC

产自嗜热脂肪芽孢杆菌（NCIM-5146）的热稳定α-半乳糖苷酶的纯化、特性表征及其底物专一性研究 摘要：采用色谱分析法，使用苯基琼脂糖凝胶4B柱，纯化嗜热脂肪芽孢杆菌（NCIM-5246）产的一种胞外热稳定α-半乳糖苷酶，获得纯组分。此酶的比活力从1.03U/mg蛋白增长到400U/mg蛋白，大约增长了389倍。采用SDS电泳Da、165.9kDa，因此推测有二聚特性。纯化的α-半乳糖苷酶是一种非糖基化蛋白，其等电点是4.9。纯化的酶的最适pH和最适温度，分别是6.5-7.0和65℃。α-半乳糖苷酶能在较广的pH范围内（3～9）保持稳定，在70℃下，失活半衰期是30分钟。 此α-半乳糖苷酶的部分N末端序列与先前报导的嗜热脂肪芽孢杆菌（NUB3621）产的α-半乳糖苷酶表现出显著的同源性（相似度达80%）。用圆二色谱法（CD）测定酶的二级结构，表现出α/β蛋白结构，并且温度处在转变温度上下时，其构想形式减少。纯化的酶与对阿仑尼乌斯阿仑尼乌斯 关键词：嗜热脂肪芽孢杆菌（NCIM-5146）；α-半乳糖苷酶；热稳定性酶；纯化；二级结构 前言 α-半乳糖苷酶（α-D-半乳糖苷酶 galactohydrolase E.C.3.2.1.22）是一种外切糖苷酶，主要是切断各种底物中的末端α-1-6-D-半乳糖残基，包括棉籽糖族的寡糖：棉籽糖、水苏糖、蜜二糖、毛蕊花糖和多聚糖：半乳甘露聚糖、刺槐豆胶和瓜尔豆胶鞘糖脂 α-半乳糖苷酶已能够从各种各样的来源中分离并纯化，包括植物、动物和微生物[5]。最近，嗜热和极度嗜热微生物产的一些α-半乳糖苷酶已被分离和特性表征[6,7]。嗜热脂肪芽孢杆菌 NUB 3621[8]、栖热菌neapolitana[9]和梭菌stercorarium[10]产的α-半乳糖苷酶的克隆及序列分析已经报道。同样地、大米[11]和里氏木霉[12]中的α-半乳糖苷酶的晶体结构也已解析。但是，很少的信息可以用在酶结构和催化机理，以及产自嗜热微生物的α-半乳糖苷酶的抗热性的机理[13]。 在早先的文章[14]中，我们发现菌种嗜热脂肪芽孢杆菌 NCIM 5146 合成α-半乳糖苷酶非常有效率。为了研究酶的结构功能关系，有必要通过简单而有效率的纯化方法来获得大量的单纯的形态的α-半乳糖苷酶。在当前的研究中，我们叙述了一种单独的色谱分析法以纯化嗜热脂肪芽孢杆菌（NCIM 5146）产的α-半乳糖苷酶。纯化的酶用来表征它的生化和分子特性，也表征其对低聚和高聚底物的底物专一性。 材料和方法 2.1材料 对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖（pNPG），邻硝基酚-α-D-吡喃半乳糖（oNPG），棉籽糖，水苏糖，蜜二糖，3-O-α-D-吡喃半乳糖基-D-半乳二糖，4-O-α-D-吡喃半乳糖基-D-吡喃半乳糖和其他所有底物，葡糖糖，半乳糖，甘露糖，乳糖，聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶过滤标记物，考马斯亮蓝 R-250与溴酚蓝，购自Sigma化学公司，美国。葡聚糖凝胶-300，苯基琼脂糖凝胶CL-4B，Pharmacia，瑞典，葡糖糖氧化酶过氧化酶（GOD-POD）试剂盒，当地化学试剂公司。所有的其他化学试剂均是分析纯。 2.1材料 2.2.1. 微生物和培养条件 嗜热细菌嗜热脂肪芽孢杆菌（NCIM）用于当前研究由前述保存[14]。为了纯化α-半乳糖苷酶，菌落生长在含有0.2%（w/v）半乳糖作为碳源，0.3%（w/v）K2HPO4，0.1%（w/v）KH2PO4和0.3%（w/v）酵母提取物作为氮源的培养基上。培养基最初的pH是7.0。在含有50ml培养基的250ml的锥形瓶中进行发酵。瓶中注入12h菌龄的由前述准备好的菌种（2%）[14]，在60℃下置于200rpm转速的旋转振荡器上培养24h。发酵结束后，生物质由离心分离（7000g。10min） α-半乳糖苷酶鉴定和蛋白质测定 由前所述，α-半乳糖苷酶活性测定是通过测定在65℃下10min水解对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖的速率[14]。当其他低聚半乳糖和多聚糖作为底物时，用Nelson方法测定产生的还原糖[15]。而蜜二糖水解释放的葡糖糖用葡糖糖氧化酶过氧化酶方法（GOD-POD）来预测[16]。一个单位的酶活力定义为：在测试条件下每分钟释放1μmol产物（对硝基酚，邻硝基酚或半乳糖/葡糖糖）所需要的酶量。 低聚半乳糖的水解产物用波层色谱法（TLC）（预涂硅胶板，Merck）定性分析。薄板在含有正丙醇：乙酸；水（1:1:0.1，v/v/v）为溶剂体系的饱和蒸汽室中室温下培养。培养之后，薄层板喷撒以1%（w/v）溶解在含10%（v/v）的磷酸的无水乙醇的α-萘酸、，然后在烘箱保持140℃5min，以可视化糖斑点。 发酵液和纯化的酶制剂的蛋白质浓度用Lowry法测定[17]。同时280nm下的吸光度测定