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纳米抗体为基础的酶联免疫法在甲醇中测定在农产品中黄曲霉毒素的耐性 摘要：噬菌体展示文库（NB）的重链抗体的重链（VHH）或纳米抗体的可变结构域，通过免疫羊驼与 黄曲霉毒素B1（AFB 1）缀合牛血清白蛋白（AFB 1-BSA）构建，选择特定的二黄曲霉毒素B1纳米抗体。与所获得的纳米抗体相比，抗黄曲霉素的单克隆抗体B5在有机溶剂和高温下更稳定。特别是温度高达95℃时，暴露在高温中的两个纳米抗体可以与抗原结合 。此外，纳米抗体在有机溶剂显示出较好耐受性。在IC 50值线性范围是从0.117到5.676纳克/毫升中，以纳米抗体Nb26竞争性ELISA可以分析黄曲霉毒素B1测定得出的0.754纳克/毫升（2.4μM），由于在甲醇中具有高耐受性，通过纳米抗体的基于ELISA对样品提取分析未经稀释就直接进行分析。从尖刺花生，水稻，玉米和饲料的回收率为80％至115％。总之，分离纳米抗体是中黄曲霉毒素的测定免疫程序的最佳选择。 黄曲霉毒素首先在20世纪60年代发现的，由于 的“火鸡X”病在从巴西进口的花生粕和其代谢产物UK.1曲霉爆发菌中发现，并且证明是疾病爆发的原因。黄曲霉毒素是一类天然存在的霉菌毒素，主要是由黄曲霉和黑paraciticus生产。他们可发生于多种产品，包括粮食，食品 和饲料。超过20种黄曲霉毒素已鉴定，其中，四黄曲霉毒素（B1，B2，G1和G2）自然发生。黄曲霉毒素B1是最毒的，且所述一个最有力的致癌性的。它已被列为第一类致癌物。这是对人类致癌，由国际机构癌症研究机构（IARC）世界卫生组织（WHO）在1993.3确定。黄曲霉毒素M1 （黄曲霉毒素M1），是黄曲霉毒素B1的代谢产物羟基化。如果被污染的食物或饲料被吞入，它可以是在哺乳动物尿液和牛奶中发现。AFM1污染物可发生在商业奶及奶制品，从而成为潜在的健康危害给人类。 由于高毒性的黄曲霉毒素和致癌性，在食品和农业产品，对于黄曲霉毒素B1或总黄曲霉毒素（黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2）检测，许多国家都建立了严格的最大允许限度，变化范围的2至20微克公斤。在食品安全的担忧和官方立法方面，准确而灵敏的测定黄曲霉毒素成为一个重要的需要。各种各样的分析方法可黄曲霉毒素测定，从精确的分析以快速方式（例如，高效液相色谱串联质谱spectrometry6）（例如，imunochromatographic assay7）。黄曲霉毒素特异性抗体不仅需要像immunoassays（免疫测定）的方法，同时也用仪器筛查方法检测用于免疫亲和纯化，它是一个标准的清理过程。 在过去的几十年里，无数的抗黄曲霉毒素已经开发了通过polyclonal（多克隆）和monoclonal(单克隆技术)应用于各种测定法。随着时代的发展分子工程和表面展示技术，抗体生产已经从传统的抗体移动到的重组抗体。黄曲霉毒素特异性重组抗体例如Fab和scFv抗体已经被开发并利用酶联免疫吸附和生物传感器方面。然而，由于这些抗体的低表达产率和稳定性片段，该应用该技术的结果是有问题的。骆驼产生抗体的独特的子类这自然缺乏轻链，称为重链antibody.。重链的抗原结合位点抗体是由重的可变结构域单独形成，这些VHHs链（VHH）重新组合表达可产生单域重链抗体，也称为VHH抗体或纳米抗体。与传统的相比，纳米抗体发展是更容易重组抗体。例如，一个相对小型文库够实现抗原特异性结合剂，只有一对引物是足够的，以放大整个纳米抗体的基因从而表达产率较高，在培养基可达30毫克的L-1。纳米抗体片段具有亲水性残基取代 框架二个区域，从而更可溶比起常规抗体片段。由于它们的单结构域性质，在高温和有机溶剂环境当中，纳米抗体也被证明是更稳定。有了这些好处，纳米抗体在下一代免疫当中是有很好的发展前景。 由于其良好的性能，纳米抗体技术有被广泛地应用于诊断和治疗领域。一越来越多的纳米抗体的已单独分离出小分子应用于更多的免疫测定当中。但是，没有对黄曲霉毒素特异性纳米抗体的报道，除了中国出版评价的两个洗脱效率 在非免疫噬菌体生物淘洗方法显示的VHH 图库对AFB1-BSA的报道，另一份报告是有关抗独特型的黄曲霉毒素的纳米抗体从抗黄曲霉毒素隔离出来的通过单克隆抗体免疫VHH库，这些纳米抗体识别该单克隆的抗原决定簇抗体和可被用作替代物的黄曲霉毒素的半抗原如涂层抗原。免疫文库更直接导致纳米抗体具有较高的亲和力。在本研究中，我们的目标是从免疫噬菌体显示库分离针对黄曲霉毒素纳米抗体来。我们也有兴趣在评估其物理化学性质，并将其与对比单克隆抗体，如耐热性，耐溶剂的效果影响。 实验部分 材料与试剂。所有试剂均为分析纯级，除非另有规定。 Antiaflatoxin单克隆抗体（mAb）B5产生于我们的实验室。 黄曲霉毒素 B1，B2，G1，G2，M1标准，牛血清