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第十二章 层析技术 主要内容 第一节 概述 第二节 吸附层析技术 第三节 凝胶层析技术 第四节 离子交换层析技术 第五节 亲和层析技术 硅胶—— 作吸附层析剂，还可作为其他层析剂的基质 在碱性水溶液中不稳定，应用的常规pH为2-8 活性硅胶为多孔的，吸附作用与本身含水量有关 硅胶的活化、再生 可分离氨基酸衍生物、甾体激素、皂苷类、类脂及色素等 氧化铝 常用的亲水性吸附剂，较高吸附容量，分离效果好，尤其适用于亲脂性成分的分离 吸附活性与含水量相关 羟基磷灰石 吸附容量高，稳定性好，可制备及纯化蛋白质、酶、核酸、病毒等 （二）有机吸附剂：活性炭 一、亲和层析的分离原理 END! 四、凝胶柱层析的操作 层析剂选择和预处理 装柱 平衡 上样 洗脱 检测 收集 层析剂再生和保存 根据样品确定分离范围，从而选择合适型号的凝胶——应将大分子完全排阻而小分子完全渗透。 适当的颗粒度： 颗粒小，分辨率高，但相对流速慢，有时会造成扩散现象严重； 颗粒大，流速快，分辨率较低但条件得当也可以得到满意的结果。 1、凝胶选择 2、凝胶的处理 估算用量：首先要根据选择的层析柱估算出凝胶的用量。 溶胀：在10倍以上的水中（或洗脱剂）充分溶胀倾泻法去悬浮物小颗粒减压排气 3、层析柱的选择 层析柱的直径和长度比一般在1:25－1:100之间。 将柱子洗涤干净 安装柱并调垂直 关闭层析柱出水口，并加入少量洗脱液检漏及排气泡 将处理好的填料缓慢装入柱中，同时打开出水口，控制适当流速 使填料等均匀沉降，并不断加入填料溶液 使柱中填料表面平坦并在表面上留有2-3cm高的缓冲液，同时关闭出水口 4、装柱 柱子装好后，要用所需洗脱液（有一定的pH和离子强度）平衡柱子。用恒流泵在恒定压力下走柱子（平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同）。平衡液体积一般为3-5倍柱床体积，以保证平衡后柱床体积稳定及基质充分平衡。 如果需要，可用兰色葡聚糖2000在恒压下走柱，如色带均匀下降，则说明柱子是均匀的。 加样体积应低于5%的床体积。 加样时应缓慢小心地将样品溶液加到固定相表面，尽量避免冲击基质，以保持基质表面平坦。 5、平衡 6、加样 凝胶的保存一般是反复洗涤去除蛋白等杂质，然后加入适当的抗菌剂，通常加入0.02％的叠氮化钠（也可置于乙醇溶液中），4℃左右保存。 7、检测、 收集 应注意洗脱时的速率和压力。 6、洗脱 检测器检测。 按时间、体积收集，或按检测曲线收集。 8、凝胶的保存 1. 生物大分子的纯化 2. 分子量测定 3. 脱盐及去除小分子杂质 五、凝胶层析的应用 第四节 离子交换层析技术 离子交换剂——不溶于水的带有电荷基团的惰性高分子聚合物。包括三部分： 一、基本原理 依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化。 交换反应：活性离子与溶液中其它的离子基团发生可逆的 阳离子交换剂—活性离子带正电的与带正电的离子基团发生交换 阴离子交换剂—活性离子带负电的与带负电的离子基团发生交换 高分子聚合物骨架 电荷基团 活性离子 二、离子交换剂的类型 活性基团：—SO3H 典型交换反应：R SO3H + NaCl R SO3Na + HCl 特点：使用时不受pH限制 注：磷酸基—PO(OH)2和次磷酸基—PHO(OH)作为活性基团的树脂具有中等强度的酸性. 凝胶型离子交换树脂—溶胀空隙 大孔型离子交换树脂---永久型空隙 离子交换树脂，多糖基类离子交换剂 （一）树脂型 1．凝胶型 （1）强酸性阳离子交换树脂 （2）弱酸性阳离子交换树脂 特点：羧基树脂在pH7溶液中才能发生交换反应 羟基树脂在pH9溶液中才能发生交换反应 活性基团：羧基—COOH，酚羟基—OH 典型反应：RCOOH+NaOH RCOONa+H2O （3）强碱性阴离子交换树脂 典型反应：RN（CH3)3OH+NaCl RN（CH3)3Cl+NaOH 特 点：使用不受pH限制。 + C2H4OH N— CH3 CH3 强碱Ⅱ型： 活性基团： + CH3 N— CH3 CH3 强碱Ⅰ型： （4）弱碱性阴离子交换树脂 活性基团：伯胺基 —NH2 仲氨基=NH 叔氨基 N等 特点：酸性溶液中使用 典型反应：RNH3OH+HCl RNH3Cl+H2O 2.大网格离子交换树脂 与凝胶型树脂比较有以下优点： 交联度高，具有较好的化学和物理稳定性