胰蛋白酶的脱盐及精制方法.pptVIP

胰蛋白酶的脱盐及精制方法 组员： 白佳幸 张 鑫 江茹兰、梁美芳 一、胰蛋白酶简介 胰蛋白酶系自牛、羊或猪胰中提取的一种蛋白水解酶，这种肽链内切酶，只断裂赖氨酸或精氨酸的羧基参与形成的肽键。 白色或米黄色结晶性粉末，溶于水，不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚。分子量为24 000，最适pH值7.8～8.5左右，当pH9.0时不可逆失活。Ca2+对酶活性有稳定作用；重金属离子、有机磷化合物、DFP、天然胰蛋白酶抑制剂对其活性有强烈抑制。 作用用途 本品为蛋白质水解酶，能选择地水解蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，能消化溶解变性蛋白质，对未变性的蛋白质无作用，因此，能使脓痰液、血凝块等分解、变稀，易于引流排除，加速创面净化，促进肉芽组织新生，此外还有抗炎症作用。 临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等。喷雾吸入，用于呼吸道疾病。也可用于治疗毒蛇咬伤。还常用于动物细胞培养前对组织的处理。 工业上用于皮革制造、生丝处理、食品加工等。 二、提取操作—分离原理 在动物胰脏中除了存在胰蛋白酶外，还有另外两种与胰蛋白酶性质相似的蛋白水解酶：胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶。在胰蛋白酶提取过程中，三者彼此很难分开。需采用合适的方法进一步分离纯化。 从动物胰脏中提取胰蛋白酶，一般是用稀酸将胰腺细胞中含有的胰蛋白酶原提取出来，然后根据等电点沉淀的原理将提取液的pH值调至酸性（pH3.0左右），使大量的酸性蛋白沉淀出来。沉淀物经水溶解并调至pH8.0，用极少量的胰蛋白酶将胰蛋白酶原激活，同时溶液中的胰凝乳蛋白酶原和弹性蛋白酶原也被激活，三种酶原相互作用过程如下： 也可采用从胰脏中提取出胰蛋白酶原，利用合适的提取溶液的pH值促使胰蛋白酶原部分自溶，并通过溶液中Ca2+的环境，使胰蛋白酶原被开始自溶的少量具有活性的胰蛋白酶所激活，转变为具有活性的胰蛋白酶（胰凝乳蛋白酶原及弹性蛋白酶原亦同时被胰蛋白酶激活成有活性的酶）。 激活后的酶溶液再进一步分离纯化。 ［试剂和器材］ 1、试剂 （1）pH2.5～3.0乙酸化的水溶液 （2）10%（积分数）乙酸 （3）2mol/L硫酸 （4）固体硫酸铵 （5）无水CaCl2 （6）结晶胰蛋白酶 （7）25%乙醇溶液(含 0.015mol/ＬHCl 、0.05mol/ＬCaCl2) （8）95%乙醇 （9）5mol/Ｌ NaOH （10）丙酮 2、器材 （1）胰脏 （2）组织捣碎机 （3）离心机 （4）磁力搅拌器 （5）透析袋、20目筛网、纱布、水浴锅 （6）烧杯、量筒、刻度吸管、试管、玻璃漏斗 （7）布氏漏斗、抽滤瓶、温度计、滴管、玻璃搅棒、纱布、pH试纸等 ［方法和步骤］ 方法一 1、 胰蛋白酶原的提取 取新鲜猪胰脏约150g，剥去结缔组织和脂肪，取净重100g，切成碎块，在组织捣碎机中捣碎，并加入2倍体积预冷的pH2.5～3.0 乙酸化水溶液，制成匀浆。浆液倒入500mL烧杯中，用10%（体积分数）乙酸调节pH在2.5～3.0之间，在5～10℃下提取6h以上，并间隙轻轻搅拌。用4层纱布过滤，尽量挤出滤液。组织残渣中再加入0.5倍体积（约50mL左右）预冷的pH2.5～3.0乙酸化水溶液再提取一次（放置1～2h），再用4层纱布过滤。合并两次滤液，用2.5mol/L硫酸调节滤液pH在2.5～3.0之间，4℃放置4h（pH始终保持在2.5～3.0），使提取液中酸性蛋白沉淀析出。提取液用折叠滤纸于玻璃漏斗中自然过滤，收集滤液，量取体积（约200mL左右）。 滤液中加入粉末状固体硫酸铵，使溶液达 0.75饱和度（每升滤液加492g，5℃）。放置过夜，使胰蛋白酶原完全析出。次日抽滤，弃滤液，压紧并收集滤饼，即胰蛋白酶原粗品。 2、 胰蛋白酶原的激活 将胰蛋白酶原粗品称重（湿重），分次加入10倍体积预冷的蒸馏水（按滤饼重量计算），使滤饼完全溶解（一般情况滤饼中硫酸铵含量约占饼重1/4）。用5mol/L NaOH将溶液调至pH8.0，慢慢地搅拌下加入固