试验一遗传分子标记系列试验.docVIP

实验一:遗传分子标记系列实验 一、实验目的:通过不同个体基因组遗传分子标记的检测了解遗传标记多态性的应用意义， 本文档由【中文word文档库】提供，转载分发敬请保留本信息； 中文word文档库免费提供海量范文、教育、学习、政策、报告和经济类word文档。 掌握检测技术方法。 二、实验原理： 在整个人类基因组中大约有5-10万个微卫星DNA的重复单位，微卫星DNA指DNA基因组中小于10个核苷酸的简单重复序列，广泛存在于真核基因组中，多数以2-6个碱基为核心单位、重复10-60次、长度50-150bp的串联重复排列的序列。由于微卫星DNA在基因组中分布广、数目多，在人群中表现出多态现象，且符合孟德尔遗传规律，因而为连锁分析提供了大量遗传标记，微卫星DNA因基因重复单位很短，所以又称短串联重复序列（short tandem repeats, STR）、简单重复序列（simple sequence repeat,SSR）。微卫星DNA由于基因重复单位小，重复次数有较大变化，所以又称为可变的串联重复单位。 不同人体基因组卫星DNA重复单位的数目是可变的，因此，形成了极其复杂的等位基因片段长度多态性。根据这一规律，应用STR基因分型技术就可将不同个体进行区别，并可进行个体间的遗传学分析，从而进行个体识别和亲权鉴定。近年来，这一技术也广泛应用于考古学、遗传学以及肿瘤学等领域。1. 按处理样品数准备1.5 ml离心管，并各加入GenTLE Solution I 500 μl。 2． 把混合均匀的100 μl血液，加入到分装好的GenTLE Solution I的离心管中，立即振荡数秒钟*1。 *1 不管处理多少样品，血液加入到GenTLE Solution I中，要立即进行振荡混合，否 则有可能降低收量。 3． 室温放置10分钟以上，然后在室温*2条件下12,000 rpm以上离心5分钟。离心时，请注意离心管在离心机里的摆放方向要统一，离心管的小耳朵朝上（见下图A）。此时几乎看不到DNA沉淀。 *2 若离心温度低，会对收量和纯度有影响，请于20℃以上离心。 4. 用移液枪小心除去管中溶液，此时沉淀看不清，紧贴在离心管外侧（带小耳朵一侧）的内壁上，除 去溶液时，请一定注意枪头不要碰到离心管外侧的内壁，插到离心管内侧的底部（见下图B），注意不要吸走沉淀物。 5. 加入1 ml的GenTLE Solution II。此时GenTLE Solution II应沿着离心管内侧的内壁加入到离心管中（见下图C）。 6. 轻柔地上下颠倒离心管数次*3，室温12,000 rpm以上离心2分钟，用移液枪小心地除去上清溶液 （方法参见实验操作4.）。 *3 剧烈振荡将影响收量和纯度。 7. 向离心管中加入GenTLE Solution III 500 μl，轻微振荡10秒钟充分混合。 8. 室温12,000 rpm以上离心5分钟，把上清溶液移至另一个新的离心管中。 9. 加入等体积（500 μl）的异丙醇，上下轻柔颠倒数次，均匀混合。 10. 4℃、12,000 rpm离心5分钟，小心除去上清溶液*4。 *4 GenTLE Solution III中含有影响酶反应的物质，所以一定要除净上清溶液，但应注意不要吸走沉淀。 11. 加入1 ml的70%乙醇清洗沉淀，4℃、12,000 rpm离心5分钟，小心地除去上清溶液（方法参见*4）。 12. 干燥沉淀*5。 *5 因为该方法提取的DNA较大，完整性好，所以请一定不要干燥过度。Tube中看不到有明显的液 体或没有乙醇气味后，就可以加入TE进行溶解。如果沉淀已经变白，说明干燥过度，此时加入TE，可能沉淀不能完全溶解，DNA的收量可能会受到影响。 13. 根据下一步实验需要，用10～50 μl适当的缓冲液（例如TE缓冲液等）溶解沉淀。 图 特别注意 操作步骤4（除去GenTLE Solution I和血液混合物）以及操作步骤9（除去GenTLE Solution III 和异丙醇混合物）的实验操作特别重要，请严格按操作方法进行。 PCR反应扩增遗传分子标记 以不同位点引物扩增不同个体遗传分子片断扩增 A1：Primer F:5-ATGAAATCAACAGAGGCTTG Primer R:5-ACTGCAGTCCAATCTGGGT A2：Primer F:5-TTTTTGTATTTCATGTGTACATTCG Primer R:5-CGTAGCTATAATTAGTTCATTTTCA 反应体系如下: 基因组DNA 0.5 引物A1或A2 1 10Buffer 2.5 dNTP 0.5 Taq