从猪肝中分离醇脱氢酶方案设计.docVIP

毕业设计作品 从猪肝中分离醇脱氢酶方案设计 前言 乙醇脱氢酶，英文缩写ADH，属于氧化还原酶类，在生物体内广泛存在，随着科学研究的不断深入，越来越多的ADH的同工酶被发现，其生理生化功能也在一步步被揭示。其用途也在一个一个地被开发出来。无论是科研还是生产，都需要大量的不同纯度的乙醇脱氢酶。动物的肝脏、肾脏、肠胃以及脑组织中都发现有乙醇脱氢酶。在肝脏，ADH主要分布于中枢周围的肝细胞；在肾脏，ADH主要分布在小肾上皮；胃肠道中ADH主要分布在粘膜内。ADH也分布在大脑组织和小脑的浦肯细胞内，还具有很高活性。目前医学和科研上所使用的乙醇脱氢酶大多数是从马肝中分离出来的。早在1984年，人们就知道了马肝ADH的三维结构，到目前为止，已经发现了85种ADH同工酶，但马肝资源有限。猪肝中也含有ADH，猪肝资源丰富，如何从猪肝中大量地分离纯化乙醇脱氢酶，成为科学工作者需要关注的问题。特别是在国内，高纯度的乙醇脱氢酶全依赖于进口，制约着我国科学工作者对乙醇脱氢酶的研究和开发，如何利用本土资源分离纯化得到大量的乙醇脱氢酶，更值得我国科研工作者探讨。本设计探讨从猪肝中分离纯化乙醇脱氢酶，对拓展乙醇脱氢酶来源，提高猪肝的附加值都有现实意义。 1 材料与方法 1.1 材料：猪肝（从刚宰杀的猪体内获取），牛血清蛋白，NAD，考马斯亮蓝G250，聚丙烯酰胺，三羟甲基氨基甲烷[Tris]，其他化学试剂均为国产分析纯 1.2 仪器：分光光度计，搅拌器，高速冷冻离心机，恒温水浴，电泳仪 2 实验方法 2.1 酶的提取与纯化 在清除结缔组织的新鲜猪肝50克加入0.06mol/L磷酸氢二钠缓冲液150mL，破碎10分钟，37℃浸提2小时，再在室温下浸提1小时，6000r/min低温（4℃）离心15分钟，将上清液迅速加热到55℃，维持15分钟，迅速冷却至0℃，6000r/min离心10分钟，上清液冷却至-2℃以下，加入-2℃以下的丙酮（每100mL上清液加50mL丙酮），边加边慢慢搅拌，低温离心，取上清液加-2℃以下的冷丙酮（每100mL上清液加冷丙酮55mL），6000r/min低温离心15分钟，弃去上清液，将沉淀溶于少量0.05mol/LTris-HCl缓冲液，上SephadexG-100层析柱，用相同缓冲液洗脱，收集洗脱的具有活性的酶液上DEAE-cellulose离子交换层析柱，用浓度为0.1-0.4mol/L的NaCl梯度溶液洗脱。每步纯化操作后取2ml样液用于测蛋白质浓度和酶活力 2.2 蛋白质浓度测定：采用考马斯亮蓝法。 试剂 标准蛋白质溶液：可用牛血清清蛋白（经微量凯氏定氮法测定其纯度）配制成1mol/L的溶液。或根据牛血清清蛋白的紫外消光系数A1%1cm=6.6来确定； 蛋白染色剂的配制：称取100mg考马斯亮蓝G250溶于50mL95%乙醇，加入100mL85%（m/V）磷酸，将溶液用水稀释到1000mL。试剂的终浓度为0.01%考马斯亮蓝G250，4.7%（m/V）乙醇和8.5%（m/V）磷酸。 操作 标准曲线的绘制 取7支试管，分别加入04，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6mL标准蛋白质溶液，用水补足到2mL。 取8支试管，0号管加入0.1mL蒸馏水，1~7号管依次加入0.1mL步骤(1)的标准蛋白质稀释液，然后各加入5mL蛋白染色剂，充分振荡混合，2分钟后于595nm测定光吸收值。以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线作为宣的依据。 样品测定 取样品溶液（含蛋白质约0.1~0.8mg/mL）0.1mL，用制定标准曲线的方法测595nm吸光度，用标准曲线计算蛋白质含量。 2.3酶活力测定 样液及酶制剂均须用0.01mol/LK2HPO4溶液稀释，稀释倍数如下： 粗提取液：K2HPO4溶液=1：4（V/V）； 热变性去杂蛋白样液：K2HPO4溶液=1：9（V/V）； 有机溶剂去杂蛋白样液：K2HPO4溶液=1：9（V/V）； 酶制剂：K2HPO4溶液=1：9（V/V）。 吸取0.06mol/L焦磷酸钠溶液0.5ml，3mol/L乙醇溶液0.1mL，0.0015mol/LNAD溶液0.1mL，蒸馏水2.2mL，置于石英比色杯中，加入已稀释的样液或酶制剂0.1mL，立即混匀，测定A340，以后每隔15秒测一次，直至A340不变，记录反应时间和A340的读数。 于另一石英比色杯中，以蒸馏水代替底物，作空白试验。 每分钟A340增加0.001为1活力单位。 3结果 3.1猪肝新鲜程度对醇脱氢酶活力的影响 在30℃的室温条件下每隔1小时取5g猪肝加10mL0.06mol/L磷酸氢二钠缓冲液破碎离心后测蛋白质含量和酶活力结果如下： 3.2温度对ADH浸提的影响 取60克猪肝加120mL浆，分别在25℃、35℃、45℃的水浴