药理学实验设计--探的究CAPE(咖啡酸苯乙酯)对结肠癌多药耐药性的逆转作用.docVIP

实验题目： 探究CAPE（咖啡酸苯乙酯）对结肠癌多药耐药性的逆转作用 实验背景： 结直肠癌（Colorectal cancer, CRC）是人类高发的恶性肿瘤，全球结肠癌的发病率一直居高不下，截止至2011年的统计数据显示，美围CRC每年死亡人数占总死亡人数的9.9%，仅次于肺癌，位于第二位[1]。在我国，截止2005年结直肠癌发病数和死亡数分别达17.2万和9.9万[2]，死亡率也一直处在比较高的水平，所以说结肠癌是的问题。 CAPE是近几年来研究的抗肿瘤药物国内外研究表明，蜂胶中的CAPE对黑素瘤、结肠癌和胃癌细胞系的作用极为强烈，表现出抑制癌细胞的特性。有研究显示，CAPE可诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡，其作用机制可能与CAPE抑FAK—ERK信号转导通路的激活有关[]，同时，其他研究的结果显示CAPE可以降低JNK—paxillin信号通路的活性，从而在体外抑制人肠癌细胞HT-29的生长。 这些研究目的多在于针对CAPE抑制基因复制或其产物表达的过程，并没有对于CAPE是否能够逆转结肠癌的多药耐药性进行研究，所以我们的课题目的在于探究CAPE能否逆转这种多药耐药性。 实验目的及意义 1. 研究CAPE对于结肠癌的多药耐药性有无逆转作用，探讨CAPE对结肠癌的化疗效果。. 针对结肠癌的现状，进行有意义的实验，以确定CAPE的临床应用价值。 实验原理：多药耐药性 多药耐药（MDR）系指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药性的同时，对其他多种结构不同、作用靶位不同的抗肿瘤药物也有耐药性。随着肿瘤化疗药物的广泛应用，肿瘤的耐药性问题越来越突出，已成为肿瘤有效治疗的主要障碍之一。 在多药耐药性发生过程中，肿瘤细胞高表达的是P-糖蛋白（P－gp），此种糖蛋白能够将抗肿瘤药物逆浓度从细胞内泵出到细胞外，降低细胞内药物浓度而导致肿瘤耐药[]。这种糖蛋白是由1281个氨基酸组成的两个完全相同的单体构成，每个单体均有6个跨膜区和1个三磷酸腺苷（ATP）结合点。跨膜区作为膜通道有利于药物转运，而ATP结合点与能量供应有关。大量研究证明，P－gp高表达伴随肿瘤患者预后不良，如低缓解率、高复发率、化疗疗效差、生存期短，可作为肿瘤患者预后的评价指标。 Hamilton等[]首次发现维拉帕米、环孢菌素A(CsA)能与化疗药物竞争性结合P-gp，可以逆转大肠癌MDR。但其心肾毒性及免疫抑制作用明显，限制了临床应用。1976年，Juliano[9]等在中国仓鼠卵巢癌细胞中，发现了一种与MDR成正相关的高分子糖蛋白，命名为P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）． P-gp由定位于7，q21.1mdr1（multidrug resistance 1）基因编码，属于ABC（APT-binding cassette）簇转运因子，是一种跨膜糖蛋白，由1 280个氨基酸组成，整个分子由完全相同的2个单体构成，每个单体具有6个跨膜区和1个ATP结合位点，跨膜区作为膜通道有利于物质转运，ATP结合位点与能量供应有关[10]．P-gp定位于胞质膜，在人体正常组织中广泛表达[11]，如胃肠道、肝、肾的上皮细胞，脑、睾丸、卵巢、肾上腺的毛细血管。推测其可能与细胞的物质转运和解毒有关，是物种进化过程中抵御有害因素的基础。当正常细胞演变成恶性细胞时，仍继续表达mdr1基因，因此临床上来源于这些组织的肿瘤，对初始化疗就具有耐药性，此为天然性耐药。已证实大约30％的AML患者在初诊时就有P-gp的表达，而大于50％的AML复发患者有P-gp表达[12]。 P-gp的检测方法Western blot P-糖蛋白经电泳分离后转移到硝酸纤维薄膜上，用抗P-gp 单克隆抗体作为一抗，酶标二抗进行免疫印迹反应，与底物显色，常用化学发光ECL 底物和DAB 底物，化学发光底物灵敏度大大高于显色底物，较常用此方法利用特异性抗体鉴定蛋白质，排除了其它蛋白质的干扰，可同时检测内参半定量蛋白含量，是目前国内外常用的检测蛋白方法MTT还原法测定细胞毒性 四氮唑[MTT3-(4，5-dimethylibiazol-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide]是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中与NADP相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的甲臜 (formazan)，而死的细胞则无此功能。用二甲基亚砜(DMSO)溶解甲臜后，溶液呈紫（红）色在一定波长（490nm）下用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率CAPE以及5-FUIC50的数值有重要意义。 IC50 IC50是指被抑制一半时抑制剂的浓度，可以理解为一定浓度的某种药物诱导肿瘤细胞凋亡50%，该浓度称为50%抑制浓度，即凋亡细胞与全部细胞数之比等于50%时所对应的浓度，IC