ELISA分析采用间接ELISA检测抗血清效价.docVIP

ELISA分析　采用间接ELISA检测抗血清效价。用pH 9.6, 0.05 mol.L-1的碳酸盐缓冲液将纯化的重组稀释为20μg·mL -1 , 包被酶标板, 每孔100μL, 4℃包被过夜。次日每孔加入100μL 5%的脱脂奶粉, 37℃封闭1 h后, 用pH 74 的PBST洗涤3次。然后每孔加入200～5 200倍稀释的兔抗血清100μL, 阴性对照为150倍稀释的免疫前血清, 空白对照为兔抗血清稀释液( PBS) , 每份样品均做1平行, 37℃孵育1 h后, 同上洗涤3次。再次每孔加入100μL HRP标记的羊抗兔IgG, 37℃孵育1 h后, 同上洗涤3次。接下来每孔加入100μL TMB显色液, 37℃避光反应20 min后, 每孔再加入50μL 2 mol·L-1硫酸终止液。最后, 在酶标仪上测450 nm下的OD值。EL ISA分析结果 兔抗蚌热休克蛋白的血清进行间接ELISA 检测时, 当(样品吸光值-空白吸光值) / (阴性吸光值- 空白吸光值) 2.1即认为是阳性, 经计算,此研究制备的兔抗血清效价为1：12800 (表1)。 间接ELISA 的操作 按间接ELISA法进行测定: 用0.1 mol/ L的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液将包被抗原稀释至工作浓度,每孔加100μL，37℃孵育1h ,再放入4℃冰箱过夜,弃去孔内液体,用PBST洗涤缓冲液洗三遍,每遍3min (以下简称洗涤)；每孔加1.5% 明胶封闭液200μL,37℃温箱放置1h后,洗涤;将血清百倍比稀释后每孔加入100μL ,37℃温箱放置1h后,洗涤;每孔加入1∶1500HRP-羊抗鼠IgG 100μL, 37℃温箱放置1h后,洗涤,每孔加新鲜配制的TMB-H2O2底物液100μL室温反应15min;每孔加终止液1mol/L硫酸50μL,15min内用酶标仪于波长450nm 处测定OD值。每块板同时设空白对照孔、阴性对照孔和阳性对照孔,以待测孔的OD值大于或等于阴性对照孔的2.1倍者,即P/N大于或等于2.1,判为阳性。 抗血清效价的测定采用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA): 将抗原稀释于包被缓冲液(0.1 mol/LNa2CO3，pH 9.6) 中，终浓度为5ng/μL，每孔加50μL。并设立空白对照(只加包被缓冲液)。4℃包被过夜后。用1×PBST (1×PBS + (0. 1%) Tween 20)于室温下洗涤3 次，每次5 min。然后每孔加200μL封闭液(10%的小牛血清溶于1×PBS中)，4℃封闭过夜。1×PBST洗涤3次。加入一抗，血清样品按1∶100;1∶200倍比稀释于1×PBS中，每孔100μL，阴性孔加入100μL 1∶200阴性血清，空白孔加入100μL 1∶100样品血清。37℃孵育2 h。1×PBST洗涤3次。加入酶标二抗，酶标二抗按说明书，1∶1 000稀释于1×PBS中，每孔50μL，37℃，2 h。显色，显色液［5 mg OPD (邻苯二胺);4μL 30% H2O2;10 mL底物缓冲液( 0. 2 mol /L Na2HPO4，0.1 mol /L柠檬酸钠)］，每孔100μL，37℃，至阴性孔显色时，加入50μL 2 mol /L H2SO4终止。酶标仪上判读结果。 1.2.5 抗血清的检测 采用间接ELISA法测定CDK7 和cyclin H两种抗血清的效价，步骤如下： 用纯化后的CDK7 和cyclin H原核表达产物作为抗原，分别包被两个反应板(抗原浓度为1 mg/ml，每抗原孔加100 ml)。3%BSA封闭后以未免疫的兔血清作为阴性对照，免疫后的抗血清作为一抗；辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG 作为二抗；经TMB显色后用H2SO4终止反应，用酶标仪在450 nm 处读取数值。 间接ELISA 1. 溶液准备：包被液：50mM Na2CO3（pH9.6），20mM Tris-HCl（pH8.5）或10mM PBS（pH7.2） 封闭液：一般封闭用BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶等 洗涤液：0.02-0.05% Tween-20的0.1M磷酸盐缓冲液或者Tris盐缓冲液（pH7.4） 2. 实验程序： 1） 将抗原按适当浓度溶解于包被液中。 2） 在对应的孔中加入100μl抗原，室温孵育2h或4过夜。 3） 倒空液体并拍干残留液体，用300μl洗涤液清洗两次。 4） 每个孔中加300μl封闭液，孵育1h. 5） 倒空液体并拍干残留液体，用300μl洗涤液清洗两次。 6） 每个孔中加100μl一抗，37孵育1h或室温孵育3h. 7） 倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加满洗涤液，倒空液体并拍干残留液体，重复3次。 8） 每个孔中加1