PCR技术与癌基因检测研究现状.docVIP

PCR技术与癌基因检测研究现状 闫小君许昌泰 第四军医大学全军基因诊断技术研究所 PCR 在突变基因检测中应用 　　基因突变(gene mutation)是遗传病和肿瘤发生的根本原因,检测与遗传病及恶性肿瘤发生有关的突变基因(mutant gene)是分子生物学,医学遗传学及肿瘤学研究的热点,它对阐明遗传病和肿瘤发生的分子生物学基础及其诊断和早期诊断具有重要的意义。分子生物学技术的发展,尤其是PCR技术的出现及近年来以PCR技术为基础,结合传统技术的突变基因分析方法为人们提供了许多快速、简便、准确的基因分析途径,并取得了令人瞩目的成果 ［1,2］ 。 　　广义而言，基因突变包括点突变,染色体突变和基因组突变3 种形式,只是它仍所涉及的范围不同,后两种基因突变涉及的基因较多,可通过光学显微镜分析细胞有丝分裂中期的染色体而检出，亦可在间期用标记探针检出,点突变通常涉及的范围较少,是肿癌和遗传病发生的主要分子改变[3-5]。因此,它是基因分析的主要研究内容。不同类型的基因突变有不同的检测途径,大致方法包括:应用基因探针直接检测；应用PCR技术检测；利用探针技术进行分析等。 　　PCR技术是一门新型快速诊断技术,它利用热稳定的DNA合成酶-Taq多聚酶,在体外合成特异的DNA片段,两条寡核苷酸引物结合在待扩增DNA的两侧,通过反复循环的DNA变性,退火和延伸,短时间内可使目的DNA得到大量扩增。这种方法是检测癌基因的最有效方法,尤其是癌基因在结构上微小改变如重排,缺失,扩增,突变等都能快速诊断。癌基因表达水平的高低也能用定量PCR快速诊断,尤其运用PCR定点突变技术可以改变物种的遗传性状,在肿瘤的基因治疗方面得到广泛应用 [6、7] 。 　　以PCR技术为基础建立的基因突变检测技术有多种,但目前较为广泛应用的为PCR-SSCP、PCR-ASO及PCR循环直接测序等,现介绍如下。 1．PCR-RFLP技术 PCR-RFLP全称多聚酶链反应(PCR)一限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）分析。主要包括靶基因PCR扩增和扩增的DNA片段限制性酶切图谱（长度多态性）。可将目的基因片段扩增百万倍以上,而且无需标记或放射性探针杂交过程。主要用于核酸变异性分析与比较,当DNA或RNA分子由于单碱基突变或序列重排,使某种酶切位点增加,减少或消失,导致限制性酶切片段长度发生改变,就产生了限制性片段长度多态性,由于限制性内切酶在DNA分子上有特异的酶切位点,根据其识别序列的位置和数量,可以把大小相似而序列有差异DNA切割成不同的片段通过核酸电泳,将长度不等的DNA片分离而显出其长度多态性（片段的大小）。PCR-RFLP用于基因分析具有分辨率高、重复性好、简便快速直观等优点,主要用于微生物的分群分型分亚型、癌基因分析、遗传病的诊断、HLA分型及载脂蛋白基因的分析等。 2. PCR-SSCP技术 PCR-SSCP是聚合酶链反应一单链构象多态性分析（single strand conformation poly morphism）,原理是将经扩增的DNA片段经过变性处理,形成单链,由于序列不同,单链构象就有差异,在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率不同,通过与标准物的对比,即可检测出有无突变。SSCP技术具有经济、快速、灵敏等特点。 3. PCR-southern blot或dot blot技术 是将PCR扩增产物转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上,再与标记的特异性探针进行杂交,然后放射自显影,检测有无特定的扩增片段及相对含量,可以直接检测癌基因的点突变,缺失及重排,比PCR产物EB染色电泳分离法的灵敏度至少要高10倍以上。由于非放射性同位素标记探针的应用,使得PCR-southern blot应用更简便,现已广泛应用于癌基因,遗传特异基因,病原体特异基因等方面的研究及检测。PCR-dot blot即将PCR扩增产物变性后直接点在膜上,与标记的特异性探针进行杂交,它耗时短,可用于半定量分析,一张膜上可同时检测多个样品,缺点是只能看到一个斑点,必须小心控制反应条件,设立阳性及阴性对照,以便对待检测标本做出正确鉴定。 4．不对称PCR直接测序法 扩增产物的测序,可以很容易确定群体中某一特定基因的序列变异情况,这种方法是了解目的基因突变的最理想方法。在扩增反应中加入不等量的两段寡核苷酸引物,通过PCR扩增获得单链DNA,然后利用双脱氧法直接测序,即确定有无突变。 5．原位PCR技术 即聚合酶链原位扩增技术,是将PCR技术与原位杂交技术结合起来,不改变与周围组织的原位位置关系,直接在组织,细胞或病原体原位研究基因变化的技术。不仅能提高了杂交的灵敏度,又能直接置显微镜下观察病变部位