PCR扩增目的片段分子生物学实验.docVIP

PCR扩增目的片段 实验目的 1、掌握PCR法扩增目的基因片段的基本原理与方法； 2、通过PCR验证目的基因片段是否插入质粒中； 3、充分理解本学期三次分子实验的原理、联系与意义。 二、实验原理 1.PCR技术基本原理 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增一定长度的DNA片段。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。 在高温（94℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在普通Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以d NTP为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增10 倍以上。 2.利用PCR扩增验证目的的基因片段 本实验的目的是验证目的基因片段是否插入pUC19质粒中并对比插入的是否为预期目的基因片段。首先，根据上次实验的酶切结果，可以初步得知本组目的基因片段是否插入pUC19质粒及插入片段的大小；然后，因为目的基因片段插入到了酶切后的pUC19质粒中，也就是插入到了其多克隆位点（MCS）中，所以使用多克隆位点的上下游引物就可以把包括目的基因片段在内的多克隆位点扩增出来；最后，若目的基因片段插入到了pUC19质粒中，则扩增之后使用琼脂糖凝胶电泳就可以通过比对Marker来分析pUC19质粒中是否插入了目的基因片段。 实验材料 试剂 Taq DNA polymerase、10*PCR buffer、MgCl2、d NTP、ddH2O、10*loading buffer、TAE buffer、琼脂糖、DL2000 plus marker、引物混合物、插入目的基因的pUC19（模板）; 仪器 薄壁PCR管，PCR扩增仪，微量移液器，量筒，微波炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，凝胶成像检测仪，梳子，手套。 实验步骤 稀释模板 我们将本组要进行PCR扩增的质粒模板进行了20倍稀释（取1ul质粒加19ul ddH2O）。 PCR体系的配制 根据本组重组质粒的酶切结果可知，我们质粒中插入的目的基因片段的大小大都为125bp左右，我们又使用了老师提供的模板，插入的目的基因片段大小为564bp。因此，本组进行PCR扩增的模板共有三组，插入片段大小按照点样顺序分别为：125bp、125bp和2564kb。 我们先将除模板之外的三组体系一起配好，按照表1，将所列试剂依次加入PCR管中，然后分别加入模板，放入PCR仪内。 表1 PCR反应各组分及其体积 体系各成分 用 量(μL) sterile water 13.6 10× buffer（含Mg+） 2.0 M13F（10uM） 0.8 M13R（10uM） 0.8 模板(约10ng/ul) 1.0 dNTP(2.5m mol L-1) 1.6 Taq酶(5u/uL) 0.2 3、按照下表编辑PCR程序并设置反应 step1 94℃ 3 min 预变性 step2 94℃ 30s 变性 step3 58℃ 30s 复性 step4 72℃ 1min 延伸 step5 GO TO step2 循环29次 step6 72℃ 10 min 延伸 step7 4℃ —— 保存 step8 End 4、PCR扩增产物的电泳检测 1%琼脂糖凝胶电泳：20uL PCR产物加入2.0uL 10*上样缓冲液，混合均匀，取5uL点样。100V恒压电泳约40min。（DL-2000 plus marker） 同时把酶切产物电泳。大片段点样6uL（10uL样品+6*Buffer 3uL），小片段点样13uL（20uL样品+10*Buffer 2uL） 实验结果 实验结果（如图1所示）