PCR扩增及其扩增回收片断的重组与转化.docxVIP

PCR扩增及其扩增回收片断的重组与转程雅楠摘要：以R-pGEX-4T-1质粒DNA为实验对象，对其进行双酶切与电泳检测，并以R-pGEX-4T-1质粒DNA为DNA模版进行PCR扩增，对其扩增产物进行鉴定与纯化，通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，并对获得的产物进行割胶纯化回收，为接下来的DNA重组和转化实验提供外源DNA片段。在进行DNA重组转化之前，进行大肠杆菌感受态细胞的制备以便将重组DNA导入其中。通过一系列的实验操作流程，掌握质粒DNA双酶切的原理和操作方法，学习PCR反应的基本原理与实验技术、PCR扩增产物的鉴定与纯化、掌握大肠杆菌感受态细胞的制备的方法和技术以及学习重组DNA连接与转化的方法。关键词：质粒DNA,PCR扩增,重组,转化。1.材料和方法1.1实验仪器与用具：水浴锅、移液枪和枪头、制冰机、浮板、小离心管、PCR热循环仪、琼脂糖凝胶电泳系统、紫外投射仪、台式离心机、移液枪（配套枪头）、－20℃低温冰箱、分析天平、水浴锅 （65 ℃）、小离心管、1.5mL离心管、50mL离心管、单面刀片、超净工作台冷冻离心机、恒温摇床、－70℃冰箱、10mL移液管、吸耳球、超净工作台恒温培养箱、玻璃涂棒、培养皿水浴锅 PCR热循环仪 实验试剂XhoⅠ酶、EcoRⅠ酶、10×H Buffer、无菌水、2.5mmol/L dNTP（TaKaRa）、10×PCR缓冲液（TaKaRa）、25mmol/L MgCl2 （TaKaRa）、琼脂糖、1×TAE、6×Loading Buffer、DNA Marker 2000 、Agarose Gel DNA Purification Kit（博彩生物）、超纯水（无菌）、引物1、引物2（5pmol/μL）引物1：5’-CGGAATTCATGGACGGTCAGA-3’引物2：5’-GCGTCGACTCATTCAGATTTGCG-3’、Taq DNA聚合酶（TaKaRa）。DNA marker 2000（TaKaRa公司）、10mg/mL溴化乙锭溶液（EB）（0.5μg/mL终浓度，20mL胶加1μL）、10×Loading Buffer、1%SDS/50%Glycerol(甘油)/ 0.05% Bromophenol Blue (溴酚蓝) 、X-gal、IPTG、氨苄青霉素、pMD18-T Vector（TaKaRa连接试剂盒）、LB固体/液体培养基、大肠杆菌DH5α（R-,M-，Amp-）、0.1mol/LCaCl2溶液、LB液体培养基、30％甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压灭菌。 1.3 实验材料R-pGEX-4T-1质粒DNA、DNA模板（质粒R-pGEX-4T-1，R指代外源基因）、PCR扩增产物、PCR基因扩增回收片段。1.4质粒DNA的双酶切与电泳检测1.4.1质粒DNA的双酶切10×H Buffer2μL 质粒DNA 10μL～12μL≤1μg 无菌水 6μL ～ 4μL EcoRⅠ1μL XhoⅠ 1μL 总体积20μL（无菌水补至总体积）反应体系：反应条件：温度37℃，酶切1.5h 1.4.2 电泳检测双酶切结果琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果：制备1％琼脂糖凝胶（含 0.5μg/mLEB），120V电泳20分钟（最高电压不超过5V/cm）。凝胶成像系统记录结果（电泳图）1.5 PCR基因的扩增1.5.1在0.5mL Eppendorf管内配制25μL反应体系，按下表准确加入各反应物 反应物 体积（μL） 10×PCR缓冲液 2.5 25mmol/L MgCl2 1.5 2.5mmol/LdNTP 2.0 引物1 2.0 引物2 2.0 Taq DNA聚合酶 0.2 模板DNA(1ng/μL) 2.0 加ddH2O至25μL 1.5.2 PCR反应条件的设置：在PCR热循环仪上设置程序，按程序设置的条件进行扩增94 ℃预变性5min，94 ℃变性40sec，55 ℃退火50sec，72 ℃延伸50sec，72 ℃延伸8min，12 ℃ for ever，1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果（此步骤与下次实验PCR扩增产物的割胶纯化一起进行）1.6 PCR扩增产物鉴定与纯化电泳检测PCR扩增产物：使用1×TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，1%的胶，30ml（参照琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验）在紫外灯下切出含有目的DNA（约600bp）的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体，切碎胶块，以加快后续步骤的胶块融化时间，提高DNA的回收率注意：尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，减少凝胶体积，提高DNA回收率；且不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤