PCR技术克隆目的基因全过程.docVIP

实验：目的基因克隆（PCR技术）Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul PCR 反应五要素： 参加 PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+ 引物： 引物是 PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理 论上，只要知道任何一段模板 DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用 PCR 就可将模板DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则： ① 引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 ② 引物扩增跨度： 以 200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至 10kb 的片段。 ③ 引物碱基：G+C 含量以 40-60%为宜，G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④ 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是 3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 ⑤ 引物 3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致 PCR 失败。 ⑥ 引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。 ⑦ 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 引物量： 每条引物的浓度 0.1～1umol 或 10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 酶及其浓度： 目前有两种 Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反应约需酶量 2.5U(指总反应体积为 100ul 时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP 的质量与浓度：dNTP 的质量与浓度和 PCR 扩增效率有密切关系，dNTP 粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP 溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以 1M NaOH 或 1M Tris。HCl的缓冲液将其 PH调节到 7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使 dNTP 降解。在 PCR 反应中，dNTP 应为 50～200umol/L， 尤其是注意 4 种 dNTP 的浓度要相等( 等摩尔配制)， 如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低 PCR 产物的产量。dNTP 能与 Mg2+结合，使游离的 Mg2+浓度降低。 模板(靶基因)核酸：模板核酸的量与纯化程度，是 PCR 成败与否的关键环节之一，传统的 DNA 纯化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 来消化处理标本。SDS 的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶 K 能水解消化蛋白质，特别是与 DNA 结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR 反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于 PCR 扩增。RNA 模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K 法，要防止 RNase降解 RNA。 Mg2+ 浓度： Mg2+ 对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的 PCR 反应中，各种 dNTP 浓度为 200umol/L时，Mg2+浓度为 1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。 PCR 反应条件的选择 PCR 反应条件为温度、时间和循环次数。 温度与时间的设置： 基于 PCR 原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链 DNA 在 90～95℃变性，再迅速冷却至 40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至 70～75℃，在 Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为 100～300bp 时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用 94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度 Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。 ① 变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致 PCR 失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板 DNA变性，若低于 93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或 PCR