TLR4介导AngII的致炎信号通路及PPARα-γ激动剂的干预中英文摘要.docVIP

论文中英文摘要 作者姓名：姬媛媛 论文题目：TLR4介导Ang II的致炎信号通路及PPARα/γ激动剂的干预 ：动脉粥样硬化（atherosclerosis, As）是缺血性心脑血管病的病理基础, 目前认为属慢性炎症性或自身免疫性疾病，但发病机制尚未完全清楚。Toll样受体（toll-like receptors, TLRs）是一类重要的模式识别受体，作为新的炎症信号传递门户蛋白，是免疫反应、慢性炎症和脂代谢紊乱间的桥梁。 血管紧张素II（angiotensin II, Ang II）在As等疾病的发病机制中扮演重要角色。Ang II与其受体结合后激活多种信号通路，诱导血管细胞释放多种细胞因子及生长因子，诱发血管炎性反应，导致As发生发展，但Ang II致炎效应与TLR4之间的关系及相关信号通路，国内外尚未见报道。 过氧化物酶增殖体激活受体（peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs）是一类由配体激活的核转录因子，与代谢、炎症及As发生等有关。PPARα激动剂非诺贝特和PPARγ激动剂罗格列酮具有抗炎和抗As作用，但作用机制并不完全清楚，是否与干扰TLR4的信号转导有关尚不十分清楚。 ： 1. 观察Ang II对血管平滑肌细胞（VSMCs）中TLR4表达及炎性因子产生的影响，探讨Ang II的致炎效应与TLR4信号通路的关系，为阐明As的发病机制提供新的理论依据； 2. 研究非诺贝特和罗格列酮对Ang II刺激的VSMCs中TLR4表达及炎性因子产生的影响和分子机制，以期阐明PPARs激动剂新的抗炎和抗As作用机制。 研究方法： 1. 动物实验 利用微渗透泵大鼠皮下埋植方法，在体输注Ang II（150 ng/kg/min），同时灌胃给非诺贝特（150 mg/kg）和罗格列酮（5、10 mg/kg）。用放射免疫法测定血清TNF-α和血浆6-酮-前列腺素F1α （6-keto-PGF1α）；免疫荧光双标染色法检测主动脉平滑肌TLR4和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达；western blot、real-time PCR法检测主动脉平滑肌TLR4、MMP-9、PPARα及PPARγ表达。 2. 细胞培养和处理 原代培养大鼠VSMCs，以不同浓度Ang II（10-910-6 M）和LPS（50200 ng/ml）刺激细胞；另一组预先1 h加入非诺贝特（25100 μM）或罗格列酮（2.510 μM），再用10-7 M Ang II 刺激12、24、36、48 h后，用ELISA法测定细胞上清液中TNF-α和6-keto-PGF1α，细胞免疫荧光染色法检测VSMCs中TLR4和MMP-9表达，同法检测VSMCs中TLR4、MMP-9、PPARα及PPARγ表达。 3. Ang II刺激VSMCs产生炎性因子的TLR4信号通路研究 预先1 h加入TLR4阻断剂，再用10-7 M Ang II刺激细胞24 h，同法测定细胞上清液TNF-α和6-keto-PGF1α、VSMCs中MMP-9、PPARα及 PPARγ的表达。 预先30 min加入AT1抑制剂losartan、AT2抑制剂PD123319、ERK1/2抑制剂PD098059或不同的联合，再用10-7 M Ang II刺激细胞24 h，同法检测VSMCs中TLR4表达。 预先30 min加入TLR4阻断剂，再用10-7 M Ang II 刺激细胞24 h，同法检测VSMCs中IP-10表达。 预先1 h加入IP-10阻断剂，再用10-7 M Ang II刺激细胞24 h，同法检测VSMCs中PKC表达。 预先1 h加入PKC抑制剂白菜屈红碱（CH），再用10-7 M Ang II刺激细胞24 h，同法检测细胞中NF-κBp65表达。 4. 小分子干扰RNA（small-interfering RNA, siRNA） 培养VSMCs，按照试剂盒说明用DharmaFECT 2转染试剂将TLR4 siRNA, IP-10 siRNA或 negative control siRNA（NC siRNA）瞬时转入VSMCs中。在转染NC siRNA或TLR4 siRNA 48 h后，预先1 h加入非诺贝特（100 μM）或罗格列酮（10 μM），用10-7 M Ang II刺激细胞24 h，同法测定细胞上清液TNF-α和6-keto-PGF1α、VSMCs中MMP-9、PPARα和PPARγ mRNA表达。 5. 非诺贝特和罗格列酮对Ang II刺激VSMCs产生炎性因子TLR4信号通路的影响研究 预先1 h加入TLR4阻断剂，再给予非诺贝特（100 μM）或罗格列酮（10 μM）作用1 h，然后用10-7 M Ang II