兰花DNA的优化提取开题报告.docVIP

兰花DNA的优化提取 1.立题依据 1.1 论文题目及研究领域 1.1.1 论文题目: 兰花DNA的优化提取 1.1.2 研究领域:在分子遗传的应用 论文研究的理论意义及应用价值 兰花一般是指兰科植物(Orchlidaceae)，它包括五个品种春兰(Cymbidium goe-ring)、蕙兰 (Cymbidium)、寒兰(Cyambidum Makion)、墨兰(Cymbidium sinense)建兰（Censifoli-um）它是鲜花植物中最大科之一，全世界约有800多属，25000多种，分布于世界各地，大多数种类分布于东南亚、澳大利亚、中南美洲、非洲和马达加斯加。我国的野生兰科植物约有173属，1240多种，在南北各地均有分布，但以云南、台湾、海南最为丰富。因而鉴别起来比较困难，而现在采用分子标记进行兰花品种鉴别是一种比较有效的方法，而进行分子标记实验时，DNA的浓度和纯度的要求都是相当严格的。 1.3目前研究的概况和发展趋势 迄今为止，国内外报道的植物DNA提取方法多达好几十种，如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法[4]，十二烷基磺酸钠(SDS)法[1]，高盐低pH法[1]，碱裂解法[3]，Zigenhagen法[7]，脲法[6]，Draper and Scott法[9]，Csclgradient法[7]，CTAB/Cscl gradient法[5]，苯酚法[14]，DNAzol peagent法[12]。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)方法和SDS(十二烷基磺酸钠)方法是目前最常用的两种[9]，它们都是一种强去污剂。CTAB具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里，在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和除大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸，因此，CTAB可以用于从大量产生粘性多糖的植物制备纯化DNA[13]。而SDS可使细胞膜及核膜破裂，因此被用来分离DNA[11]。该分离过程的第一步是用热的去污剂(SDS)进行抽提物置于0℃并加入高摩尔浓度的乙酸钾，离心去除不溶物，以去除蛋白质和多糖等杂质。 2. 论文研究的内容 2.1 论文重点解决的问题 2.2 论文拟开展的几个大方面 2.2.1 SDS方法和CTAB方法提取 2.2.2 实验结果分析 2.2.3 结果讨论 2.3 论文拟得出的主要结论 选择出兰花的优化提取方法（SDS方法或CTAB方法） 3．论文拟采用的研究方法 3.1 拟采用的主要研究方法 用SDS和CTAB方法提取兰花DNA，并进行比较，通过实验结果来选择兰花的优化提取方法。 3.1.1 实验材料 都江堰市西川花卉市场购买的材料兰花包括春兰(Cymbidium goe-ring)、蕙兰(Cymbidium)、寒兰(Cyambidum Makion)、墨兰(Cymbidium sinense)。 3.1. 2 实验仪器 天平、研体和研棒、恒温水浴锅、冰盒、泠冻离心机、冰箱、微量离心移液器、微量离心机、50ml离心管等。 3.1.3 实验试剂 液氮、TBE缓冲液、异丙醇、1×CTAB缓冲液、氯仿/异戊醇(24：1)、0.2mol/ml乙酸纳、5×TBE缓冲液等。 3.1.4 实验方法 3.1.4.1 1×CTAB法提取兰花DNA （1） 将2g新鲜兰花叶片用液氮速冻，然后在研体中将其磨碎，在化冻之前将粉末转移至50 ml聚丙烯离心管中，然后加入20 ml预热至90度的1×CTAB提取一离心管中提取缓冲液。轻轻转动离心管，混匀，然后置于65℃水浴放置40分钟。 （2） 混合物泠至室温后加入等体积的氯仿/异戊醇。轻轻颠倒离心管几次使管内混合物构成乳状液。室温5000转/分钟离心10分钟分相。 （3） 将上清液(水相)转移至一干净离心管中，37℃保温30分钟。 （4） 加入0.7体积的异丙醇，仔细混匀，室温放置15分钟沉淀DNA。 （5） 用一玻璃钩将DNA钩出，并转移至一装有50ml 70%乙醇，0.2mol/L乙酸钠的干净离心管中，冰上放置20分钟，然后转移至一装有5ml 70%乙醇的离心管中，冰上旋转5分钟。 （6） 将DNA转移至一干净离心管中，空气干燥10分钟，溶于尽可能少的TE缓冲液(可多达5 ml。视DNA的量和纯度而定),4℃保存 3.1.4.2 SDS法提取兰花DNA （1） 将2克新鲜兰花的叶片置于液氮中速冻，然后在研体中将其磨碎，将泠冻 粉末转移至50 ml 离心管中加入15 ml提取缓冲液。轻轻旋转混匀。 （2） 加入1ml 20%SDS，混匀，65℃保温10分钟，并不时轻旋转混匀。 （3） 加入5ml 5mol/L乙酸钾，混匀后冰上放置20—30分钟。用14