学科论文~PCR技术的研究发展及其广泛应用.docVIP

PCR技术的研究发展及其广泛应用 贾金凤 （哈师大生命科学与技术学院，哈尔滨，150025） 摘要：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）简称PCR技术，是一种体外酶促合成, 扩增特定DNA 片段的方法。现已广泛应用于分子生物学等各个领域。传统的PCR技术有许多的不足，所以多重PCR技术已经应运而生。本文主要是就PCR技术的研究发展及其应用做简要介绍，并对其未来的进步与改革提出展望。 关键词：PCR；多重荧光PCR；应用；前景 随着生物技术的发展，以物种间基因差异为基础的分子学鉴定方法成为研技术究的热点。主要原因是: ①DNA 比蛋白质的耐热性强，高温处理过的食品中仍能提取出小片段的DNA; ②分子学鉴定方法不依赖于组织和细胞的类型; ③不同的基因片段进化效率不同，可以根据实验目的选择不同的目的基因进行研究;④DNA 比蛋白质具有更高的种间多态性，有利于品种鉴定。传统PCR技术最早于1985年由美国的K array 等创立并由美国Cetus公司开发。其基本原理是将待扩增的DNA置于高温下使之解链，人工合成的两个寡核苷引物在低温下分别与目的片段两侧的两条链互补结合；DNA聚合酶在72℃将单核酸从引物的3’端开始掺入，沿模板5’→3’端方向延伸，合成DNA的新互补链。行这种变性、退火和延伸反应循环，可使两引物限定范围内的DNA序列以指数形式扩增。但随着科技的发展，PCR技术也在进行着不断的完善。多重PCR( Multiplex Polymerase Chain Reaction，MPCR)技术是在常规PCR 基础上发展起来的新技术，它是在同一个反应体系中加入一对以上引物，分别扩增不同的模板，得到不同的目的片段。这种方法既保留了常规PCR 方法的特异性、敏感性，又减少了操作步骤及试剂用量，可以在同一反应中检测多种致病菌的特异基因。利用一次多重反应，可同时检测、鉴别出多种病原体。不论在致病微生物引起的传染病诊断方面，还是在环境中致病微生物的检验领域，多重PCR 技术都具有较广阔的应用前景，在临床混合感染的鉴别诊断上具有独特的优势和极高的实用价值。当前多重PCR 在病原微生物的检测广泛适用于临床、卫生防疫检测、食品卫生以及流行病学调查等。 1 传统PCR技术 传统PCR反应分为三步：变性：在高温条件下，DNA双链解离形成单链DNA；退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链；延伸：在DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达到~106~7个拷贝。该PCR技术广泛应用于微生物检测,可以克服传统检测方法的缺点和不足,还具有灵敏度高、操作简便、检测周期短、检测成本低等优点。但却不能在同一反应中得到不同的目的基因，具有一些局限性。 2 多重PCR技术的应用 2.1 多重PCR技术在手足口病疫情监测中的应用 多重荧光定量RT-PCR方法是通过在PCR 反应体系中加入荧光集团利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程， 最后对模板进行定性或定量分析。PCR 反应过程中加入荧光化学物质，随着反应的进行荧光信号强度等比例增加， 检测到的荧光信号强度可绘制成一条曲线， 通过对照标准曲线对未知模板进行定量分析。实验检测过程中， 加入一对特异性引物、两端分别标记荧光报告基团与荧光淬灭基团的特异性寡核苷酸探针，PCR 扩增时利用Taq DNA 聚合酶的5′－3′外切酶活性将探针水解成单核苷酸， 游离的荧光报告集团使荧光信号增加，通过对荧光信号的实时动态检测以对扩增产物进行定量分析，将实时荧光定量RT-PCR 技术应用于肠道病毒的检测工作， 为手足口病疫情的监测提供可靠的实验室依据。 2.2 应用多重荧光定量PCR技术快速检测甲型H1N1流感病毒 根据国家流行性感冒诊断标准及处理原则( GB15994-1995), 流行性感病原学常规的检测方法是病毒培养法(细胞培养法与鸡胚培养法)。虽然准确、可靠、稳定, 但确诊耗时至少要10~ 15 d, 而且还受限于特定的实验室条件和人员条件。实时荧光定量RT - PCR 方法从核酸的提取到完成检测, 全程仅需3~ 4 h, 而且操作方便、特异性强、灵敏度高,极大程度上缩短了甲型H 1N1流感病毒的检测时间, 为疑似甲型H1N1流感暴发疫情的实验室应急诊断提供了一种快速、有效的实验室检测手段, 且易在基层疾控部门推广。 2.3