实时荧光定量PCR技术及其在乙肝检测中的应用.docVIP

实时荧光定量PCR技术及其在乙肝检测中的应用 摘要：实时荧光定量PCR法被广泛应用于基础研究， 成为分子生物学必不可少的研究工具。与传统的PCR技术相比，实时荧光定量PCR具有快速、高特异性、高敏感度的特点，所以自1985年Mullis发明PCR技术和1988年Erlich发现耐高温的DNA聚合酶以来，该技术以惊人的速度广泛应用于生命科学的各个领域，特别是在细胞学、病毒学、肿瘤学、遗传学、法医学、动植物免疫学等方面取得了巨大的成绩，成为当代分子生物学发展史上的一个里程碑。近年来在乙肝病毒的诊断中，它为乙肝的诊断提供了直接的依据。 关键词：实时荧光定量PCR 乙肝病毒DNA 基本原理 Key words：FQ-PCR HBV-DNA Basic principles 一、引言 近年来，随着对乙型肝炎病毒(HBV)分子生物学研究的深入，以及荧光定量聚合酶链反应( FQ - PCR)检测方法的普遍开展，目前对乙型肝炎病毒检测的临床意义已有了新的认识。我们分析不同基因型HBV DNA 的序列特点，总结不同基因型的HBV DNA 序列的规律性差异,利用实时荧光定量PCR 技术建立乙肝病毒基因型的分型方法。本文就荧光定量PCR技术的原理及近年开展荧光定量PCR检测HBV - DNA以来的资料进行综合性叙述。　 二、PCR技术简介及原理 1、PCR定义 PCR即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。 2、PCR反应成分： （1）要被复制的DNA模板?界定复制范围两端的引物 4、实时荧光定量PCR 技术的基本原理 在PCR 反应体系中，除了普通PCR所需的引物外，还加入荧光染料或荧光基团，这些荧光物质有其特定的波长，作为荧光探针。仪器可以自动检出，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR 进程，在PCR 循环中，测量的信号将作为荧光阈值的坐标。一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号，可以用于定义一个样本的Ct 值。荧光信号的强弱与PCR的产物数量成正比，通常用不同浓度的标准样品的Ct 值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。方程式的斜度可以用来检查PCR 的效率， 所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数( R20.99)，这样才能认为实验的过程和数据是可信的， 使用这个方程式计算出未知样本的初始模板量[5, 6]。实时荧光定量PCR 仪都有软件， 可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。 三、荧光定量PCR的优点 荧光定量PCR是融合了PCR技术与DNA探针杂交技术的优点，实验整个过程只在加样时打开1次反应管，在PCR的每个循环中可以直接监测到荧光信号的变化，根据PCR反应酶动力学特点分析软件会自动对DNA进行定量，因此也有人称荧光定量PCR为实时荧光定量PCR。其优点为：1、荧光定量PCR解决了传统PCR技术不能定量和扩增产物污染的问题。2、避免了普通定量PCR操作过程中的污染，荧光定量PCR只在加样时打开反应管一次。3、荧光定量PCR操作简便、快捷、结果准确，不需要普通PCR扩增后进行电泳或放射自显影观察结果，方便了临床上的应用。4、荧光定量PCR可以对每一批扩增样本进行扩增效率的评价。对DNA做系列稀释，每个稀释浓度的DNA对数值与其Ct值做回归分析，PCR的扩增效率的计算方法为：效率=10-1/斜率。通过计算扩增效率可以对一起、操作人员和试剂进行综合评定。 四、实时荧光定量PCR技术应用（在乙型肝炎病毒检测方面的应用） 乙型肝炎是一种世界性传染病，我国是高流行区，我国有50%~70%的人群受过乙型肝炎病毒的感染，有8%~10%为乙型肝炎表面抗原携带者，约有一亿人口。乙肝病毒又与肝硬变以及原发性肝细胞肝癌密切相关，我国同时也是肝癌的高发国家。目前，乙肝五项检查表面抗原（HBsAg）体内是否存在乙肝病毒表面抗体（抗-HBs） 是否有保护性 （3）е抗原（HBeAg） 病毒是否复制及具有传染性е抗体（抗-HBe） 病毒复制是否受到抑制核心抗体（抗-HBc） 是否感染过乙肝病毒随着技术的发展现在可以通过HBVDNA检测反映出肝脏内是否有乙肝病毒的存在以及是否在进行复制。bsAg(+)合并HbeAg(+)者及单纯HBsAg(+)者，其HBV-DNA PCR阳性率最高，均大于95%，与文件报道的检出率97%基本相同。HBV-DNA阳性，说明患者体内病毒复制活跃，此时无论肝功能是否正常或有临床表现，都说明病情处于活动期