实验四--五 DNA连接和转化课件.ppt

实验四 DNA分子的体外连接实验五 DNA连接产物的转化与重组子的筛选 ; 在实验室一个重组DNA分子制作过程的基本步骤主要包括6个基本步骤，; 一.实验目的 学习和掌握DNA体外连接的方法与操作步骤。 学习和掌握连接产物DNA的转化方法及操作步骤。 ;二. 原理ＤＮＡ分子的体外连接;质粒必须通过转化，才能进入细菌内进行扩增。转化效率的高低与受体菌的生理状态有关。用CaCl2处理细菌可以提高细菌吸收周围环境中的DNA分子,这种状态的细菌被称为感受态细菌。 冰冷条件下，CaCl2能使细菌细胞膨胀，细胞壁通透性增强，转移到42℃下进行短暂热刺激，待转化的外源DNA便会被细胞所吸收。 决定细菌转化效率（频率）的因素有：DNA的浓度、纯度和构型；转化细胞的生长状态；在CaCl2处理和储藏之后的存活率以及转化的环境条件如：温度、pH值、离子浓度等。;互补法;β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为标记基因。 lacZ（lacZα）中含有多克隆位点，当无外源DNA片段插入时，质粒表达β—半乳糖苷酶的α-肽，与缺失突变体宿主菌（不能编码α-肽）表达的lacZ基因产物（ β链）互补，产生有活性的β—半乳糖苷酶，在含有指示剂X-gal和诱导剂IPTG的存在下，菌落呈现兰色；外源基因的插入后，破坏了lacZ α-肽基因的结构，细菌内不能产生β—半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。 β—半乳糖苷酶基因的优点: a.?酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5‘-端可容许很大的变化（如加入多克隆位点）而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大; P LacZα LacZβ;plasmid DNA; 三. 试剂与器材 〈一〉试剂 1．LB培养基: 在950ml水中加入: 　 bacto-tryptone 10g 　　 bacto-yeast extract 5g NaCl 10g 用5 mol/L　NaOH调pH至7.0 加水至1L,高压灭菌。 ;2. LB/Amp平板:在950ml水中加入: 　　 bacto-tryptone 10g bacto-yeast extract 5g NaCl 10g 用5 mol/L NaOH调pH至7.0 加15g琼脂，加水至1L,高压灭菌，冷却至50℃,加氨苄青霉素至终浓度60μg/ml。 ;IPTG储存液：200mg/ml的双蒸水溶液，用0.22μm的一次性滤器过滤除菌，-20 ℃保存。 X-gal储存液：20mg/ml的二甲基甲酰胺溶液，不必除菌，-20 ℃保存。 0.1 mol/L CaCl2感受态细胞 ;〈二〉器材 1. 37℃温箱、水浴锅、恒温振荡器 2. 高速冷冻离心机 ;四.操作步骤 ? 1、DNA片段的连接;台式离心机离心10秒以混合均匀，程序为: 8℃ 3’→ 10℃ 30’’→ 12℃ 30’’→ 14℃ 30’’→ 16℃ 5’→ 18℃ 30’’→ 4℃ 1’’(共26个循环) 再65 ℃ 30’ → 10℃ 24h ;2.? 感受态细胞的转化 (1) 在10 ?l连接反应物中取10 ?l （?50ng）加于200 ?l 感受态细菌，冰浴中放置30分钟，同时设对照：a:标准质粒DNA；b:未连接的DNA产物;c:不加DNA的感受态细胞。; (2) 42℃热激90秒后，立即放回冰浴中。3-5分钟后补加LB液体（不加抗生素）800 ?l，于37 ℃振??45-60分钟。 (3) 事先将35 ?l X-gal和8 ?l IPTG均匀涂布于一个LB(Amp+)平板上。;(4) 取100μl或200μl细菌培养液，直接涂布于此含60μg/ml氨苄青霉素的平板上，于37 ℃ 培养14-16小时，观察平板上的细