盐角草铜锌超氧化物歧化酶基因(SeCZS)的克隆及耐盐性分析.pdfVIP

摘要 世界上土地资源正日益遭受着干旱、风化、土壤盐碱化等的多种胁迫。我国分布 0.33 hm2 有广泛的盐碱地，面积约有 亿 ，还在逐步扩大，盐胁问题越来越严重。土壤 中的盐浓度高，对许多的植物造成了不可逆的伤害，抑制植物的生长，甚至造成植物 死亡。世界各国在控制和改良盐碱地方面，主要通过灌溉农业、物理化学及生物技术 等措施。目前，通过研究植物的耐盐机制，利用生物技术方法克隆耐盐植物的耐盐基 因，培育抗盐作物品种，可以有效地解决土壤盐碱化带来的不利影响。盐角草是盐角 草属一年生低矮草本植物，生于平原荒漠区湖边潮湿盐土上。它们是典型的耐盐植物， 耐盐机制受到越来越多的研究者关注。超氧化物歧化酶(SOD)是机体内可以催化超氧 O H O 阴离子生成 和 的金属酶，在生物体内广泛存在，而且可以迅速的清除活性氧。 2 2 2 研究发现，SOD 在医学、食品保健和化妆品方面都起到重要的作用，应用广泛。SOD 可以起到防御损伤的作用，与多种疾病有关，它们与植物的抗逆性方面也是密切相关 的。 本实验选取的耐盐植物为盐角草，用RACE的方法克隆出盐角草Cu/Zn-SOD基 因，使用生物学软件分析核苷酸和氨基酸序列，并进行同源性比对。构建原核表达载 体，转化大肠杆菌，使目的蛋白在重组菌中表达，并分析了不同盐浓度并含有抗生素 LB IPTG 600 OD 的液体 培养基中菌的生长情况， 诱导表达，通过测定波长为 的 值 来分析Cu/Zn-SOD基因的耐盐功能。为以后研究盐角草Cu/Zn-SOD基因的应用以及 在植物抗逆性作用中的应用奠定基础，如培育耐盐农作物新品种。 1．通过简并引物PCR 扩增和RACE 技术，克隆出盐角草Cu/Zn-SOD基因。盐 角草Cu/Zn-SOD基因（GenBank 登录号：JQ074238.2）全长为660 bp，开放阅读框 459bp 152 15.1KDa 长为 ，推测编码 个氨基酸，蛋白分子量约为 ，其氨基酸序列与碱 蓬的序列相似性为96%，与黄灯笼辣椒的序列相似性为88%。生物学软件分析表明 Cu/Zn-SOD蛋白可能存在于细胞质。 2．根据获得的盐角草Cu/Zn-SOD基因序列设计引物，扩增编码区，并在引物序 列上分别加入NotI 和BamHI 酶切位点。构建原核表达载体pET-Cu/Zn-SOD和对照 pETDuet-1，转化大肠杆菌E.coliBL21中。蛋白经IPTG诱导表达。经SDS蛋 白电泳检测发现表达蛋白条带大小与预期一致，说明目的蛋白成功表达。 3 1% 5% 6% 7% LB 10h ．将重组菌接种到含盐浓度为 、 、 、 的液体 培养基中培养， 3h OD BL21(pET-Cu/Zn-SOD) 后每 ，测定一次 600值。结果发现重组表达菌 表现出了 1-3 Cu/Zn-SOD 较明显的生长优势，与对照菌相比较，耐盐性提高了约 倍，说明盐角草 基因在植物耐盐方面可能具有一定作用。 I 关键词：盐角草，超氧化物歧化酶，基因克隆，耐盐性 II Abstract