盐地碱蓬SsNHX1基因的克隆和转基因拟南芥的培育.pdfVIP

Y56,9,0, 中文 摘 要 th胁迫条件下，植物细胞渗透均衡和离子正常均衡状志被破坏，特别是胞质中过 多的Na+对植物细胞的代谢产生毒害，影响到植物细胞的调节机制。植物细胞为适应胁 迫环境，具有一系列的适应机制，一方面积累可溶性物质:另一力一面，尤其是盐生植 物则通过Na+外排或者Na+区隔化和调整K/Na+比率的机制来保持胞质内较低的Na+ 浓度，以消除Na+的毒害，此过程中，Na十//H+反向转运蛋白起到重要作用。 甜土植物拟南芥胞内控制离子区隔化基因AtNHXJ及Na外排的基因SOS]均己克 隆，并且AtNHXI在拟南芥中的过量表达显著提高了转基因植株的耐盐性，开创了降 低Na*毒害的基因操作新途径。真盐生植物盐地碱蓬基因SsNHXI对离子均衡所起的作 用，通过SsNHXI基因在拟南芥中的过量表达，进行进一步的研究，对于植物细胞离 子均衡研究具有重要意义。 本实验对盐地碱蓬SsNHXI基因进行了克隆 (GenBank注册号AF370358)。由于 Na勺F犷反向转运蛋白基因己在拟南芥，水稻等植物中得到克隆。不同的Na勺1反向转运 蛋白基因具有保守区域，根据保守区段设计引物，扩增得到SsNHXJ的部分片段，利 用RACE方法得到其两端序列。由序列设计两端特异引物，RT-PCR扩增到SsNHXI 全长cDNA，将其克隆并进行序列分析，结果与报导的其他物种中的Na+/H+反向转运 蛋白序列具有较高的同源性aSsNHXI基因cDNA全长1665饰，编码一个分子量约61kD 的蛋白。得到SsNHXI片段后，对其在碱蓬中的拷贝数及表达特性进行了分析，Southern 结果表明SsNHXI在碱蓬中至少有3个拷贝，应是一个基因家族。Northern结果显示 SsNHXJ是受盐胁迫诱导的基因，特别是在叶中的表达更易受到盐诱导，这与其Na勺H+ 转运的功能相一致。将NHXIcDNA全长ORF克隆入表达载体pROK2中，导入根瘤 农杆菌GV3101后，由渗透法进行拟南芥遗传转化，转基因植株经分子检钡U共得到23 个独立转基因植株，PCR结果表明均有外源基因的插入，Southern结果进一步证明外 源SsNHXI己整合到拟南芥染色体组中，并有单位点插入和多位点插入的区别。选择 ENarthem7X平t不M时g价19立探索进幸尹进一步it生Yi,测试。结巢表明A胁迫条 件下转基因植株中Na+含量明显高于野生型植株，盐耐受能力高于野生型植株，可能与 Na区隔化能力的提高有关。 关键词:盐地碱蓬，SsNHXI基因，Na/H+反向转运蛋白，植物耐盐性，植物基因工程 分类号:Q945 at^一C,}-t5},f,匕-— — 一.一 — 一 一一一一“ Abstract IsolationofSsNHX1fromhalophyteSuaedasalsaandgene engineeringforArabidopsisthaliana Themaladiescausedbysaltstressarisefromthedisurptionofcellularaqueousand ionicequilibrium.Theions,especiallyNaaccumulatesexcessivelyinthecytoplasm,itcan bet6xictothemetabolismandaffecttheregulationmechanismoftheplantcell.Tocope withsaltstress,plantshavedevelopedavarietyofadaptationmechanisms.Oneisthe accumulationofthesoluteosmo-protectants,the,otheris,themechanismsofion homeostasisincludingNa+extursionsystem,orsequesterNa+intothevacuolarandregulate theratioofK+1Na+,especiallyinhalophyte.Na+/H+antiporterpl