维吉尼亚链霉菌IBL-14中胆固醇氧化酶基因的鉴定和功能分析.pdfVIP

万方数据 摘要 摘要 维吉尼亚链霉菌IBL。14是本实验室从甾体制药厂污泥中分离得到的一株能 够转化和降解甾醇类化合物(如孕酮、皮质醇等)的微生物。本研究发现其在以 胆固醇作为唯一碳源的培养基中能生长，说明维吉尼亚链霉菌IBL．14能对胆固醇 进行降解作用。胆固醇降解的第一步是在胆固醇氧化酶催化下完成的，中间参与 的辅酶是黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，整个反应分为氧化反应和异构反应，先 催化胆固醇C3位羟基氧化成羰基，生成中间产物五烯三酮，同时生成次级代谢 产物过氧化氢(H202)，然后催化C5位烯烃双键异构成C4位烯烃双键，生成最 终产物4．胆甾烯．3一酮。 本课题研究IBL．14对胆固醇的生物转化作用。研究先利用SWISSPROT、 组注释中以胆固醇为条件筛选到4个可能的胆固醇氧化酶基因，分别命名为 霉菌属中的其他菌株同源性达到85‰96％之间，进而推测四种蛋白属于GMC家 sp．SA．COO的胆固醇氧化 族。进化树构建结果显示Cho．sv04与来源Streptomyces 酶亲缘关系最近，功能可能具有相似性。 对维吉尼亚链霉菌IBL．14中的四个胆固醇氧化酶基因进行了克隆表达，得 coliBL2 BL2 coli 到E 1，最coli 1(DE3)／pHT304一cho—svO1(DE3)／pHT304一eho—sv02，E andE．coli BL21(DE3)／pHT304．cho．sv03 株。通过低温蛋白诱导和SDS．PAGE电泳检测，四种胆周醇氧化酶都得到表达， 且大部分分布在破碎上清中，这为后期的蛋白纯化和功能鉴定打下了基础。 对胆固醇氧化酶(Cho．sv04)的纯化和功能进行了初步的研究。经过 叫H4)2S04盐析、超滤及CMFF阳离子交换层析，得到初步纯化蛋白， Sepharose 终比酶活达到1．10 万方数据 维吉尼亚链霉菌IBL．14中胆固醇氧化酶基因的鉴定及功能分析 产物进行定性分析，发现发酵反应液中生成的产物与标准品4．胆甾烯．3．酮的出 峰时间一致，推测产物是4．胆甾烯．3．酮，表明Cho．sv04蛋白具有转化胆固醇的 功能。 studio Discovery2．5软件分析发现：Cho．sv04与来源于Streptomycessp．SAoCOO 的ChoA蛋白的二级结构和三级结构具有极大的相似性。利用同源建模方法以 的氨基酸序列上均有FAD结合保守序列；空间结构中具备一个口袋结构的活性 His450和Asn488，且两蛋白的关键氨基酸残基位置基本一样，推测可能具备相 同功能。已证明ChoA蛋白中His在类固醇降解过程中为类固醇羟基氧原子的氢 点突变为Leu450，发现E．coli 转化胆固醇的能力，表明His450在Cho．sv04蛋白功能中起着重要作用。 关键词：维吉尼亚链霉菌IBL．14；胆固醇氧化酶；同源建模；定点突变 II 万方数据 Abstract Abstract activatedfortreatmentof IBL-1 from 4，isolated sludge Stre