螺旋菌pcs基因在大肠杆菌中表达及磷脂酰胆碱的合成.pdfVIP

学 号 20∞357 研究类型 垫熊亟塞 』匕Z- 芗 ⑩彪汀IW，W要J置 学科专业 生物化学与分子生物学 指导教师 王行国教授 研 究生 宣文静 论文题目 螺旋菌p岱基因在大肠杆菌中 表达与磷脂酰胆碱的合成 5JJ 21I 答辩Il期： 2006年 摘要 Wfj日，螺旋菌p∞基因编码磷脂酰胆碱合成酶。磷脂酰胆碱合成酶能利用 胆碱作底物催化合成磷脂酰胆碱。本实验旨在通过建立磷脂酰胆碱合成酶(Pcs) 的大肠杆菌表达系统，让克隆的磷脂酰胆碱合成酶基因(p∞)在大肠杆菌细胞中 有效地表达，并尽可能使磷脂酰胆碱成为大肠杆菌细胞膜的主要成分，为以后研 究磷脂酰胆碱(PC)成分在大肠杆菌细胞膜系统中功能与作用、确立磷脂酰胆 碱(PC)成分与致病细菌入侵真核细胞的关系提供一个实验平台。 根据基因库中且6“，g面咖rfp甜基因序列设计引物pcsF、pcsR，以丑q却疗f 的总DNA为扩增模板，通过PCR方法扩增出705bp的磷脂酰胆碱合成酶基因 B12l 的大肠杆菌细胞JE．∞，f 带有pET23a—pcs重组质粒的E∞矗B121 ptac85一pcs重组质粒的在含有0．4％(w／v)胆碱和100mg／LAmp的LB液体培养 mmol／LE∞，f 基37℃培养，并用终浓度为0．5 ToplO的IPTG进行诱导。TLc鉴定 到了磷脂酰胆碱合成酶的合成产物PC，但是其合成量很低，不超过细菌总磷脂 数的5％。通过调节IPTlG的使用浓度、使用时间和诱导时间，胆碱的使用浓度， 以及培养基的条件，在E∞，f T0plO—pcs表达菌株中发现，当细菌的O．D．600达到 O．8加入O．5 培养2—4小时后磷脂酰胆碱(Pc)的合成量达到最大，可以占到大肠杆菌细胞 膜磷脂组分的80％以上。 此外，为了获得斛一p∞+突变株，巳构建了自杀性载体pHB02和插有抗生素基 因的磷脂酰乙醇胺合成酶基因(pss)失活片断，为采用细菌杂交方法、电转化同 源重组的方法敲除Ec甜f雎，基因作好了准备工作。 关键词：拉伊玛螺旋菌，磷脂酰胆碱合成酶，磷脂酰胆碱 lII Abstl．act encodes Bor旭，抽，p∞gene pho印hatidylcholine of V蛔Pcs researchairIlistoestablishan synthesisphoSphatidylch01inepathway．0ur E∞，fstrain、vhosecellmembme aS ablllldalltPC amodeltothe comailling study ofPCin bi0109ical铀ction prokaIyotes． BaSedon in