西尼罗病毒免疫诊断方法的建立和对入境人员的血清调查.pdfVIP

ESTABLISHⅣ匝lNTOF IⅣ瓜仉．丌呵ODU渊OSTICM匝THODOF WESTNILE VIRUSAND SERoEPIDEMIOLOGYn叮、厂]巳STIGA：nON AMONGE小盯RYPER 0套mL ADissertationSubmittedto theGraduateSchoolofHenanNormal University inPartial Fulfillmentofthe Requirements forthe of Degree MasterofScience By Yu一(；hun Wang Supervisor：Dr．ShaoQiang ProfessorHu Kong—Xin May，2014 摘要 自我组装成病毒样颗粒(virus．1ike 染293T细胞，获得大量的纯化蛋白，以此蛋白作为抗原研制检测西尼罗病毒抗体的 ELISA试剂盒，用试剂盒来实现对我国出入境人员的血清进行调查。 方法：筛选典型西尼罗病毒株，构建重组质粒，大规模转染293T细胞，优化转染 的条件和方法，表达西尼罗病毒prM-E蛋白，获得大量的表达重组蛋白，通过间接免疫 荧光实验验证表达抗原的完整性和特异性，纯化西尼罗病毒prM．E蛋白抗原，ELISA对 表达产物进行鉴定制成大规模的检测试剂盒；采用蔗糖梯度离心10．60％结合超速离心 纯化表达产物；将纯化的表达产物包被子聚苯乙烯微量反应板，与待检血清中抗WNV 抗体反应后，经洗涤，再加入辣根过氧化物酶标记羊抗人埯G与之结合，然后用TMB作 检测。 like 结果：重组质粒转染细胞后产生病毒样颗粒(virusparticlesVLPs)，优化转染的条 件和方法，从转染的293T细胞从细胞的上清液中和细胞中的表达的蛋白的的纯化物中 获得大规模的重组蛋白，通过间接免疫荧光试验表明，表达的病毒样颗粒蛋白具有良好的 抗原性；间接ELISA证实，重组蛋白可以作为抗原用于检测患者血清特异性抗体；纯化得 到的大量的蛋白包被成ELISA试剂盒，通过对来自西尼罗疫区的286份我国入境人员 血清检测，与金标准美国FOCUS的WNV WNV 率为35．6％，FOCUS 为91．18％，阴性符合率为95．34％，总符合率为92．66％。 结论：在哺乳动物细胞中表达的西尼罗病毒样颗粒具有良好的抗原性；以西尼罗病 毒样颗粒为抗原建立检NWNV抗体的问接ELISA方法，检测效果不亚于进口试剂盒，大 规模转染细胞所纯化的西尼罗病毒的重组蛋白可以实现制成大规模商品化的试剂盒，可 以以此试剂盒来对我国出入境人员进行血清学监测。 关键词：西尼罗病毒免疫荧光ELISA血清学调查 ABSTRACT To ofWestNilevirusinmammalian∞ns．293Tcells，which啪 expressprM—Eprotein self-assembleandform vi