胶原矿化机理教材.docVIP

胶原、磷灰石自装配以及模拟ECF 我们建立模型：透析过程伴随持续的胶原注入模拟细胞分泌胶原纤维生成过程。低浓度胶原酸溶液（1mg/ml）注入组织I型胶原分子的透析袋，反向透析使用浓缩的高分子PEG（300mg/ml）设置为胶原基质的最终高浓度。因为在骨组织中，钙、磷、碳酸根离子来源于ECF并且持续渗透到生物组织中，矿化过程是持续的注入碳酸磷灰石离子前体以及胶原分子来实现的。由于这个原因，最初的酸化胶原溶液和PEG聚合物溶液补充钙、磷、碳酸根离子。体外组成Ca/P摩尔比为3.3，同时碳酸根浓度为3.33mM更倾向于骨组织中B型CHA。碳酸根替代用变换红外光谱进行检测。在整个的过程中保持接近生理状态的离子浓度。中和:用氨蒸汽中和使得胶原分子沉积到纤维和碳酸羟基磷灰石之间。在酶对照组，通过化学方法控制Ph值获得胶原纤维的三螺旋结构，但是不能获得高浓度的纤维。胶原分子和磷酸钙盐的共沉淀可以使得基质有较低的矿化程度。为增加矿化程度，基质被保存在生理温度并且在模拟体液中进行搅拌并且不断补充。这样的条件下，我们称之为“动态”。在纤维生成的过程之中和之前，介质中的矿物离子模仿骨组织中的循环体液。虽然这样的ECF仍然对于多种生理功能和生化反应是有争议的，但到现在为止在文献被提及还是获得了应有的关注。 骨内胶原的基本特征 对Coll/CHA 基质进行TEM观察。在高浓度的胶原溶液中获得的基质可以观察到染色的细段嵌在基质中，纤维以螺旋状的结构进行装配，这主要是由于胶原纤维持续的扭转导致，这类似于人脱钙的致密骨中骨单位的超微结构。相反，从稀释的胶原溶液（5mg/ml）提取的基质表现出随机的胶原纤维的导向。调整胶原分子的注入率，控制溶液的粘弹性和胶原分子的自装配动力学。这个参数形成致密的同源单径分散纤维的基质，有或者没有矿物质，这是生物组织的主要特征，和之前的关于逐渐递增的胶原浓度基质的研究相比较也是显著的结构特征。横纹纤维的出现也表明在COLL/CHA基质中体外纤维生成可以被成功的诱导，但是由于染色沉淀和可能的低矿物成分，晶体很难观察到。在TEM观察的基础上，我们展示了骨、低浓度、高浓度胶原基质的纤维网状结构的图解，这使得从3D角度看胶原纤维的组成和致密度更加形象。在过程中，对易溶的胶原溶液不进行压缩和提取，提示最终的各向异性主要取决于实验条件下高浓度蛋白介导的固有的胶原特性，使得整个过程容易被复制。最终的胶原浓度由脯氨酸滴定定量检测。高胶原浓度最终结果是半个胆固醇高度约2-3um，与成年人股骨致密骨接近。可以设想骨组织中胶原的粘弹性更接近于高浓度基质而不是低浓度基质。 骨内矿化物的基本特征 广角X线衍射：研究2年龄绵羊水化骨以及水化Coll/CHA、 Coll/CHA/SBF 基质。合成的胶原基质中缺乏Ca2+,PO43- CO32- ，表现出经典的沉淀胶原衍射图像。两种矿化基质表现出HA衍射特征峰和融合峰。骨和Coll/CHA/SBF 基质的X线衍射表现出相似的模式，宽峰的属性是小晶粒或者磷酸盐的碳酸盐结构替代物。数据。 致密度的差别和矿化程度的相对差别是一致的。尽管基质中的有机无机物比很低（5%），矿物成分的量接近于浸泡于SBF中 成熟骨组织。 为了支持X线衍射的结果，对基质中嵌合的细段进行进一步TEM观察。对骨组织中的晶体组成进行TEM观察是受到限制的由于细段预备的困难以及染色的伪影。对未染色的样本进行TEM观察，由于染色颗粒和磷灰石有时难以区别。不染色也是能观察到磷灰石晶体的，因为磷灰石晶体是有电子密度的。低矿物成分的基质的TEM图像表现出相对于纤维主轴，小磷灰石晶体的侧向以及轴向排列。侧向装配的晶体径向穿过胶原纤维，类似于纤维内矿化的早期阶段；连续的磷灰石晶体沉积于胶原分子的分子间间隙以及胶原纤维的纤维间间隙阐明了钙化的后期阶段。在体外的纤维内矿物的形成可能是胶原内部或者外部或者胶原表面的成核位点。Coll/CHA/SBF的整个的超微结构表明由于高浓度的矿物成分，使得能够观察到纤维内以及纤维间间隙内的矿物。纤维是以多种模式进行排列的,表现为平行排列非定向结构。在纤维形成前，前体酸溶液表现出胆固醇局部排列以及胶原分子的各向同性区域。这些区域同样存在于基质中，与天然的骨组织的异质形态类似。考虑到胶原与磷灰石间的结构关系，晶体似乎与纤维胶原网络相匹配排列。例如在圆弧模式中，从胶原与截面平行排列的区域获得的电子衍射图像显示磷灰石晶体优先与胶原纤维主轴相匹配沿主轴排列，这种模式与成熟绵羊骨观察到的结果类似，尽管是新形成的矿物相。在Coll/CHA/SBF基质中的胶原纤维的矿化的异质性已经被低温透射电镜观察所证实。虽然没有染色但是带的模式仍然很容易被观察到，提示出晶体主要位于胶原的缺口区域。然而在某些部分，很难看到带状结构。单纤维可以表现出这种异质性