JNK通路介导的依达拉奉联合黄芪对大鼠神经元的-第三军医大学学报.docVIP

缺氧缺血性脑损伤后丰富环境刺激对大鼠海马CA1区神经元凋亡的影响 宋远见1，裴冬生1，孙亚峰1，张芳1，张兆成2，刘红芝1 （1徐州医学院基础学院，江苏徐州221004；2徐州市中小学生卫生保健所，徐州221002） 关键词：缺氧缺血性脑损伤；丰富环境；海马；JNK1/2；Bad(ser128) 中图法分类号：R72 　　文献标识码：B 缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）相关疾病已成为国人尤其是婴幼儿最主要的病死原因之一，因而积极探索缺血性脑中风导致神经元损伤和死亡的分子机制及有效防治措施，有着 基金项目：江苏省自然科学基金（BK2006035,BK2006536）；徐州市科技计划项目(xzzd0711)；江苏省普通高等学校“青蓝工程” Supported　by　the　Natural　Science　Foundation　of　Jiangsu(BK2006035,BK2006536),Technology plan of Xuzhou(xzzd0711) and Qinlan Project of ordinary colleges and universities of Jiangsu 作者简介：宋远见(1978-)，男，江苏沛县人，讲师，硕士，主要从事缺氧缺血性脑病的科研工作。电话：（0516E-mail:biosongyuanjian@126.com 极其重要的医学价值和社会意义。迄今为止对于缺氧缺血性脑中风尚无理想的治疗方法。目前普遍认为环境刺激可影响脑的形态和功能,如增厚前脑皮质, 增大神经元胞体, 增多树突分枝，增强记忆能力等[1,2]。海马CA1区是脑组织中对缺氧缺血刺激非常敏感的区域，本实验室研究发现在脑缺血后第3天c-Jun氮末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）及其下游信号物质之一Bad(ser128)的磷酸化水平升高且达到顶峰，这一变化可以导致海马CA1区神经元大量凋亡[3,4]。本实验通过研究丰富环境刺激可否对缺氧缺血性脑损伤大鼠海马CA1区JNK、bad(ser 128)和神经元的影响及其可能机制，为临床缺氧缺血性脑病的治疗提供实验基础。 1　材料与方法 1.1材料　7日龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，14～18g，清洁级，由徐州医学院实验动物中心提供，经检疫证实为健康状态。90只大鼠随机分为3组，A组即正常对照组(n=30),不建立模型,不刺激。B组即缺氧缺血非刺激组 (n=30),建立缺氧缺血性脑损伤模型,但不给丰富环境刺激。C组即丰富环境刺激组 (n=30),采用Sale法建立缺氧缺血性脑损伤模型[5],然后给以丰富环境刺激(2h/次,1次/d)共20d。单抗JNK1/2、Bad(ser128)和二抗羊抗兔IgG-AP皆购自Sigma公司，DAB染色试剂盒购自武汉博士德生化试剂公司。 1.4方法　 1.4.1 动物模型制备　参照Sale法建立新生大鼠 HIBD动物模型[5]。大鼠无水乙醚吸入麻醉后,取颈部正中切口,分离结扎左侧颈总动脉,然后置于 37℃有机玻璃缺氧箱中,持续充以气流量为 0.5 L/min的 8%氧氮混合气体2h,制成HIBD动物模型,术后夹尾左旋者纳入实验[6]。 1.4.2丰富环境　参照Sale等[5]设计。饲养笼规格为70 cm×60 cm×50 cm的半透明有机玻璃笼,笼内放置不同颜色、形状及气味的物体,包括各种质感的砂纸、毛刷、冰冷的金属和有刺激性气味的柠檬、薄荷棉球,还有转盘、管道、斜坡、秋千、跷跷板、小球等“玩具”,并配以舒缓的轻音乐。丰富环境刺激组在术前20天及术后24h即开始实施。放入丰富环境笼内4次/ d ,每次10 min。每周将环境改变2次,以造成新异的刺激,总刺激时间为20d。缺血非刺激组和正常对照组分别饲养于25cm×15cm×10cm无特殊刺激的标准环境中,刺激组在非刺激时间亦饲养于标准环境中。3组大鼠均提供12h光/12h暗昼夜光变化,自由进食进水,定期换笼。 1.4.3样品制备　每组各取10只于缺氧缺血后的第3天将大鼠快速断头取脑，冰上速取左侧海马，裂成两部分，即CA1区和CA3/DG区，将CA1区置液氮速冻。使用时，复温至-5－0℃，按1：10（质量体积比）加入冰冷的匀浆液（50 mmol/L MOPs,pH 7.4,100 mmol/L KCl,0.5μmmol/L MgCl2,0.2 mmol/L DTT,1 mmol/L Na3VO4,0.1 mmol/L EDTA,1 mmol/L EGTA,0.5 mmol/L鸟本苷,0.1 mmol/L PMSF,5μg/ml Ieupeptin和5μg/ml pepstatin