抗HCV筛查实验设置“灰区范围”的探讨.docVIP

抗HCV筛查实验设置“灰区范围”的探讨 在定性免疫测定中，确定合适的阴阳性判断值对减少假阳性和假阴性具有重要意义。处于阳性判断值定值域中的测定结果可归为可疑，即ELISA测定的“灰区”。目前国内用做传染性病原体抗原或抗体检测的ELISA试剂盒没有统一的“灰区”设置标准，而仅仅以“阳性判断值”（Cut off Value，Co值）来判断阴阳性结果，这就会涉及到检测结果低于但接近Co值的血液是否合格的问题。根据ELISA测定的Co值来判断结果，假阳/阴性不可能完全避免，其只不过是将假阳/阴性降低到较低的比例而已。那么“灰区”范围设置多大才比较合适，我们就此问题进行了初步探讨，现报告如下。 1? 材料与方法?????1．1? 样本? 2007年5月—9月，本中心初、复检抗HCV结果不一致但复核结果为阴性的样本1 394份。2006年1月—2007年9月抗HCV阳性报废的血液样本643份，并特意收集这期间初、复检结果不一致且阴性结果协方差值（Cov值）≥050的样本44份。1 NCU/ml抗HCV定值血清(批号0802)由卫生部临床检验中心提供。样本采集、保存与运输按照“全血及成分血质量要求（GB18469—2001）”中“全血的质量要求”收集全血，在血液采集后4—6 h内以1 500 r/min，15 min离心取上清收集血浆并分成3份，分别用于ELISA方法 抗HCV、FQPCR方法HCV RNA检测和复核检测。-20℃下保存期为3个月、-70℃下保存期为1年，运输采用干冰。???? 1．2? 试剂与仪器? 酶联免疫试剂盒初检试剂(厦门新创公司)、复检试剂（上海科华公司）、病毒核酸扩增荧光检测试剂盒（达安基因股份有限公司，批号：H10762）；（上海浩源生物科技有限公司，批号、复核试剂测试系统［COBAS公司 AmpliScreen HCV Test (V20)，批号：H10762］。核酸扩增实时荧光基因分析仪（达安基因股份有限公司，DA7600）、核酸自动提取系统（Chemagen公司，Magnetic Separation Module I型）、核酸提取仪（TBG公司，EZ Beads32）、PCR核酸扩增检测技术（ABI公司，7500实时PCR分析系统）、全自动样品处理机（TECAN公司，RSP200/8型）、全自动酶免分析仪（Microlab公司，FAME 24/20型）。???? 1．3? 实验设计?? 初复检筛查实验采用ELISA方法，对初次具反应性的样本用相同试剂再次双孔复试，所有阴性样本再用FQPCR方法检测。对于初、复检结果不一致的样本用FQPCR方法和COBAS AmpliScreen HCV Test (V20)测试系统检测。各项试验均严格按照试剂盒操作说明书进行。???? 1．4? 数据统计? 初、复检2遍检测均阳性的样本测试结果纳入阳性样本数据统计，对初、复检2遍检测结果不一致的，以HCV RNA检测结果和复核试剂结果为标准，如复核结果为阳性，ELISA结果数据均归入阳性统计，否则归入阴性数据统计。 2? 结果???? 2．1? 常规检测初、复检结果? 结果不一致且阴性结果Cov值≥050的样本44份，以30%作为“灰区范围”，处于“灰区范围”的样本共10份，ELISA检测结果见表1。对这些样本采用FQPCR方法和COBAS AmpliScreen HCV Test (V20)测试系统再次检测，其中1份HCV RNA阳性样本，而ELISA抗HCV结果不确定，Cov值为085—135。从而表明筛查试验结果处于“灰区范围”内的样本有可能就是阳性样本。 ??????由表1结果可知，处于“灰区范围”内的样本共10份，占本项研究全部样本的049%（10/2037），这些样本经文中方法鉴定后的真阳性和真阴性比例分别为100%（1/10）和900%（9/10）。另外，对结果不一致的样本，分别统计2种试剂阳性结果Cov平均值、 s和Cov平均值+2s，计算值分别为219、069、358；207、084、375。总Cov平均值、s和Cov平均值+2s分别为213、077、367。从而表明结果不一致的样本多为Cov值在20左右的弱阳性样本，一般情况下Cov值＜40。???? 2．2? 1394份常规检测初、复检抗HCV结果?? 结果不一致而复试结果阴性的样本，Cov值波动范围为000—155，按Cov值大小顺序排列，以005为组距，统计各组段的样本数量，计算累计频数和累计频率，制作抗HCV阴性样本Cov值频数表，结果见表2。由表2抗HCV阴性样本Cov值频数表数据，计算百分位数P25=0117、P50=0179、P