柱前衍生—反相高效液相色谱法测定N—甘氨酰—L—谷氨酰胺一水合物含量.docVIP

柱前衍生反相高效液相色谱法 测定N—甘氨酰—L—谷氨酰胺一水合物含量 摘要 目的：以2，4—二硝基氟苯（DNFB）作柱前衍生化试剂，在碱性条件下制得2，4—二硝基苯基—（N—甘氨酰—L—谷氨酰胺）（DNP—GGM）。用反相高效液相色谱（RP—HPLC）法测定N—甘氨酰—L—谷氨酰胺一水合物（GGM）含量。方法：使用日本岛津SCL—10AVP高效液相色谱仪，ODS色谱柱，以乙腈—醋酸盐缓冲液洗脱，检测波长360nm结果：GGM在16—80μg/mL范围内线性良好，r=0.9943，回归方程Y=1.2436*10-4X,RDS= 0.31%(n=5)。结论：本法可用于测定N—甘氨酰—L—谷氨酰胺一水合物的含量。 关键词：N—甘氨酰—L—谷氨酰胺一水合物，2，4—二硝基氟苯，柱前衍生，反相高效液相色谱。 N—甘氨酰—L—谷氨酰胺一水合物（N—Glycyl—L—Glutamine Monohydrate，GGM）为目前大量出口氨基酸输液的原料药，含量测定用常规方法难以解决[1~3]。本文采用DNFB[4]在碱性条件下能定量地与GGM发生置换反应生成DNP—GGM，用紫外检测器检测。在这个方法中DNP—GGM可与衍生剂水解产物（2，4—二硝基苯酚）峰获得基线分离。衍生条件简便，重现性好，对定量测定无干扰。本法可用于测定N—甘氨酰—L—谷氨酰胺一水合物的含量。 仪器、试剂、样品 日本岛津SCL—10AVP高效液相色谱工作站。试剂DNFB、冰乙酸、乙酸钠、无水碳酸钠均为分析纯，甲醇、乙腈为色谱纯，水为二次重蒸水。对照品GGM国外进口，供试品GGM为我市A药厂产品。谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）由中国药品生物制品检测所提供。 色谱条件 色谱柱ODS（4.6mm×250mm）10μm大连依利特科学仪器有限公司产品，流动相0.05mol/L醋酸钠水溶液（用冰醋酸调pH6.4）：乙腈（80：20 V/V）、检测波长360nm、进样量20μl、流速1ml/min。 溶液的配制 3.1衍生液配制， 称取DNFB105mg置25ml棕色量瓶中，加入乙腈溶解并稀释至刻度。 3.2 5%碱液配制： 称取无水碳酸钠10g，加入双蒸水至200ml搅拌溶解。 3.3 对照品与供试品溶液配制： 精密称取对照品、供试品（三批）25mg，甘氨酸8.5mg、谷氨酸16.6mg分别置于6只25ml棕色量瓶中，用5%碳酸钠水溶液溶解并稀释至刻度。 4. 实验方法与结果 4.1线性关系测定： 精密量取对照品液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml于5只25ml棕色瓶中，分别依次加入DNFB液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml置水浴中80℃加热75min，迅速冷却，加入流动相至刻度摇匀，直接取样20ml注入高效应相色谱仪，以DNP-GGM峰面积为横坐标，GGM浓度（ug/ml）为纵坐标，实验结果表明在16-80ug/ml浓度范围内经衍生化后生成的DNP-GGM峰面积与GGM浓度呈线性相关（表1）。48ug/mlGGM对照液记录色谱图（图1-A）。 表1 线性关系测得结果 GGM浓度 ug/ml DNP-GGM 峰面积 回归方程 相关系数 16 32 48 64 80 111304 237447 368774 508444 650989 Y=1.2436×10-4 X r=0。9943 4.2样品测定： 精密量取对照品液和供试品液1.2ml分别置25ml棕色量瓶中，并照上述衍生方法分别加入DNFB液1.2ml。按外标法以峰面积计算即得三批供试品测得结果（表2），48ug/ml GGM供试品液记录色谱图（图1-B）。 表2 供试品测定结果 批号 重量mg 峰面积 含量% 对照品 25．30 365166 供试品 200101 25．95 367805 98．19 200102 25．49 357386 97．14 200103 26．26 3666817 96．78 t/min A B 图1。 DNP-GGM反相高效液相色谱图 对照品DNP-GGM B. 供试品DNP-GGM 4.3重复性实验： 取供试品生产批号200103（约相当于GGM25mg）5份，精密称定，按含量检测方法测定，实验结果表明重复性良好（表3）RSD为0.31% 表3 样品重复性测定结果 份数 重量mg 峰面积 含量% 1 25．20 350356 96．32 2 25．31 351701 96．27 3 25．11 348855 96．25 4 25．24 352941 96．88 5 25．55 354288 96．0