强筋益髓灵对大鼠截瘫作用机制的研究.docVIP

强筋益髓灵对大鼠截瘫作用机制的实验研究 杜立建1，冯胜格2，王扬3吴俊喜4 石家庄市中医院；2. 石家庄炎 黄中医研究院；3. 河北师范大学校医院；4河北省中医院　审校） 关键词：强筋益髓灵 截瘫 细胞凋亡 神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP) 截瘫，是指脊髓损伤后，受伤平面以下双侧肢体感觉、运动、反射等消失和膀胱、肛门括约肌功能丧失的一种病症。其中，上述功能完全丧失者，称完全性截瘫，还有部分功能存在的，称不完全性截瘫。早期为弛缓性瘫痪，约3～4周后，逐渐转为痉挛性瘫痪。截瘫病因与脊髓外伤或本身病变有关。 1材料： 1.1实验动物：南方医科大学实验动物中心（许可证号：SCXK（粤）2004-0020）提供的SPF级健康成年SD大鼠只，, 随机分为5组（即空白组、模型组、药物对照组、大剂量治疗组、小剂量治疗组）,每组24只。每日定量供给混合动物饲料和充足水，在安静、通风、清洁环境下分笼饲养，饲养环境温度控制在22℃～25℃,相对湿度40％～70％℃冰箱 SANYO；干燥箱 湖北黄石医疗器械厂；DJ-1磁力搅拌器 江苏金坛荣华仪器制造有限公司；PB203-E精密天平 Mettler Toledo(shanghai)；PHS - 3CpH计 上海康仪仪器有限公司；紫外透射分析仪 上海天能公司；Kodak EDAS 290数码照相凝胶成像系统 Kodak；低温高速台式离心机 KUBOTA；手掌式离心机 MILLIPORE；WH-861旋涡混合器 上海市环球物化仪器厂 2.实验方法 2.1实验动物模型制作：适应性喂养7天后，除空白组外，其余四组均行体积分数为0.15的水合氯醛腹腔注射麻醉（300 mg/kg）大鼠，以T9～T11节段骨性标志为中心，沿棘突做纵行切口约4 cm，切开皮肤及浅筋膜并皮下游离，于T10节段处，用锐利刀片于硬膜外快速切割、完全横断脊髓，切除2mm脊髓节段，并见大鼠尾巴痉挛性摆动，双下肢及躯体回缩扑动后，双下肢瘫痪，表明脊髓全横断模型制备成功，医用明胶海绵填充脊髓断端间隙。 2.2试验分组处理情况：空白对照组：生理盐水灌胃1次/日，剂量2ml;模型组：生理盐水灌胃1次/日，剂量2ml;药物对照组：银杏注射液静脉注射1次/日，剂量5ml;大剂量治疗组：中药强筋益髓灵灌胃1次/日，剂量5ml（40g/kg）;小剂量治疗组：中药炎黄四虫通脉灌胃1次/日，剂量5ml（20g/kg），喂养8周。 2.3实验指标及测定方法 2.3.1用改良的Tarlov法评价造模后24及8周后观察大鼠下肢运动功能情况：Tarlov评分[1]:测评大鼠后肢运动功能状况。0分：没有自主性运动；1分：仅有髋、膝关节的非反射性运动；2分：有髋、膝、距小腿（踝）4个主要关节的运动；3分：能主动支持体质量和不协调步态，或偶尔出现协调步态；4分：前肢和后肢协调的步态，行走时有趾间关节的运动；5分：正常步态。 2.3.2光镜下观察脊髓组织的病理形态学改变：氯胺酮(30mg/kg)静脉麻醉下,行4%多聚甲醛+0·2%戊二醛液经左心灌注处死,取出脑与脊髓,置于相同灌注液中4℃下再固定48小时。解剖显微镜下将大鼠脊髓(C1~T6)则行3mm层厚轴位切开,肉眼观察记录。制作6μm厚连续切片, HE染色,供光镜观察;部分标本再作成1mm3大小的组织块, 2%戊二醛、1%四氧锇酸再固定, 618环氧树脂包埋、超薄切片,醋酸铀-枸橼酸铅染色, H-500透射电镜下观察。 2.3.3采用ABC染色测脊髓组织中GFAP的表达量。 免疫组织化学染色用ABC法进行检测 步骤：⑴切片常规脱蜡入水;⑵新鲜配制3%H202，室温处理3一10min，以消除内源性过氧化酶活性;⑶蒸馏水洗涤2min，PBS浸泡5min;⑷微波修复，暴露抗原;⑸蒸馏水洗涤2min，PBS浸泡5min;⑹5一10%正常山羊血清PBS稀释封闭，室温孵育1Omin;⑺倾去血清，滴加适当比例稀释一抗液，370C孵育60min或40C过夜;⑻PBS洗5min*3次；⑼滴加适当比例稀释的生物素，标记二抗;⑽PBS洗5min*3次；⑾滴加适当比例稀释的辣根酶标记，链酶卵白素或直接滴加其工作液，370C孵育10一30min⑿PBS洗5min*3次；⒀显色剂显色，镜下控制;⒁苏木素复染，盐酸酒精分化，碳酸锂蓝化;⒂梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。 结果判定:以细胞浆中出现棕黄色斑或颗粒为阳性细胞。然后将所得免疫组织切片在OlympusBH2显微镜下细胞计数，每只动物计数4张切片，每张切片随机取4个部位，每处0.25m2，共1mm2片。用NikonCoolpix950数码相机在01myPusHB2显微镜下摄片，HPIAS1000高清晰度彩色