法国梧桐花粉主要变应原Plaa1的纯化和鉴定.docVIP

译文 法国梧桐花粉主要变应原Pla a 1的提纯和鉴定 背景：悬铃木，例如法国梧桐，是分布于美国和西欧城市的一种重要的气传性变应原的来源。目前对该花粉的相关变应原还知之甚少。本项研究的目的是识别法国梧桐花粉的相关变应原并提纯和鉴定18 kDa的一种主要变应原的特性。 方法：使用离子交换、凝胶过滤和反相色谱层析来分离法国梧桐花粉。通过EAST、SDS、等电聚焦、免疫印迹和氨基酸测序进行分析。 结果：从法国梧桐花粉提取液中提纯得到18 kDa的蛋白质，称为Pla a 1。这种未糖基化的蛋白质的等电点高于9.3并且高达92%法国梧桐花粉单一过敏患者和83%多敏患者对它过敏。对其N-末端序列分析产生的氨基酸序列，显示与资料库中已知的蛋白质没有同源性。与单一过敏患者反应的其他相关变应原蛋白质为43和52 kDa，与免疫球蛋白（Ig）E结合的普遍率分别为83%和42%。肌动蛋白抑制蛋白（Profilin）则是多敏感患者的重要变应原。 结论：已测定法国梧桐花粉的大多数相关变应原。对这种花粉特有的主要的变应原Pla a 1已进行提纯和特性鉴定。 梧桐树或无花果树是广泛种植于美国和西欧的观赏树木，属于悬铃木属，也称法国梧桐，是一种在大多数西欧城市中最常见的树木。在一些西欧国家，花季时可检测到高浓度的这种花粉[1]-[4]，几乎达到西班牙马德里花粉总量的 14%，1994年当地记录约有7.3万棵法国梧桐[5]。尽管发现浓度很大，但是却认为法国梧桐是低致敏花粉。然而，最近在西班牙进行的研究显示皮肤点刺试验（SPT）法国梧桐花粉呈阳性的不同差异，范围从5%至56%，这取决于研究的地区[5]-[6]。虽然近几年来法国梧桐花粉在致敏反应中越来越重要，但是几乎没有报道过关于该花粉中与IgE反应的蛋白质的描述数据[6]-[7]。在本研究中，对导致单一过敏和多敏的梧桐花粉过敏患者产生花粉病症状的变应原进行了描述。而且，首次提纯了梧桐花粉主要变应原，并且阐述了它的生物化学性质和致敏重要性。 实验材料与方法 患者 患者表现为对IgE介导的法国梧桐花粉过敏[8]，相应地伴有季节性或常年性鼻炎、哮喘，或两者兼而有之的病史，与皮肤点刺试验强烈反应（西班牙毕尔巴鄂），并且产生法国梧桐花粉的特异性IgE水平要比类似酶联过敏原吸附测试（EAST）高出两个级别。12名患者（5名女性和7名男性患者，年龄为25—50岁，平均年龄为42岁）法国梧桐花粉单一过敏。18名患者（6名女性和12名男性患者，年龄为14—66岁，平均年龄为42岁）法国梧桐过敏，也对其他花粉过敏，草和橄榄花粉就是最重要的种类。特异性IgE水平通过EAST（Hytec系列特异性IgE酶免疫测定，Hycor生物医学公司，德国卡塞尔）定量测得，如制造商所描述，将法国梧桐花粉提取液结合到纸盘上[9]。 花粉粗提液的制备 法国梧桐、黑麦草和油橄榄树的花粉粗提液如前所述制备[10]。用Bradford法（考马斯亮蓝法）测定每种提取液的蛋白质浓度[11]。 18kDa的变应原的提纯和N末端氨基酸分析 离子交换层析法：法国梧桐花粉提取液过HiTrap SP柱（Amersham Pharmacia Biotech，瑞典乌普萨拉）分离，在AKTA-prime蛋白质纯化设备（Amersham Pharmacia Biotech）中使用含NaCl 0.3，0.5和1.0M的不连续梯度的20mM pH6.0的磷酸缓冲液进行平衡。通过SDS电泳和专门与这种花粉反应的患者血清（图1A，第二道）孵育进行免疫印迹来分析分离组分的致敏活性。 凝胶过滤色谱层析法：将集中的活性组分浓缩，适用在葡萄糖凝胶Superdex 75柱，在SMART设备（Amersham Pharmacia Biotech）中使用含NaCl 0.15M的20mM pH8.0的Tris缓冲液进行平衡。所有可分辨峰的组分分别集中，并进行SDS免疫印迹分析。 反相色谱层析法：集中的活性组分过μRPC C2/C18反相柱（Amersham Pharmacia Biotech），在SMART设备中使用含0.1%三氟乙酸（TFA）的10-45%浓度梯度的乙腈。与阳性血清反应的组分经集中、透析、浓缩，保存于-20℃。 依据埃德曼的降解技术，使用494 Procise蛋白质测序仪（PE Biosystems，德国威特史丹特）对Pla a 1的N末端氨基酸进行测定。 免疫检测和免疫印迹抑制实验 蛋白质在还原[12]和非还原条件下进行SDS电泳分析，并经考马斯亮蓝R250染色显现出来。分离的蛋白条带电泳转移到聚偏二氟乙烯上（PVDF膜），用含有0.1%ECL-Plus，Amersham Pharmacia Biotech）通过化学发光的方法进行检测。 免疫印迹抑制实验使用混合的患者血清进行。粗提液