JNK在cGVHD狼疮样小鼠肾组织表达及在肾纤维化中作用研究.doc

　　JNK在cGVHD狼疮样小鼠肾组织表达及在肾纤维化中作用研究 【摘要】 目的：观察cJun氨基末端激酶(JNK)在慢性移植物抗宿主病（cGVHD）狼疮样小鼠肾组织中的表达情况，初步探讨其在狼疮肾炎肾脏纤维化中所起的作用。方法：建立cGVHD狼疮样小鼠模型。将小鼠分为12周正常对照组、16周正常对照组、12周模型组及16周模型组4组，每组6只，于12周末处死12周正常对照组和12周模型组小鼠，16周末处死16周正常对照组和16周模型组小鼠，采用双缩脲比色法观察各组小鼠24 h尿蛋白排泄量，HE和Masson染色观察肾间质纤维化程度，免疫组织化学法定位检测JNK、pJNK在肾组织的表达，RTPCR法检测各组JNK mRNA表达及asson染色，在普通光镜下观察各组小鼠肾组织病理学变化。 1.5 免疫组织化学检测 SABC法行免疫组织化学染色(试剂盒购于晶美生物技术有限公司)：取2 μm厚石蜡切片脱蜡至水；加3%过氧化氢溶液，室温下孵育10 min；滴加胃蛋白酶修复抗原，37 ℃孵育15 min；加含10%羊血清的封闭液在室温下封闭30 min；滴加兔抗小鼠JNK、pJNK(Thr183/Tyr185)多克隆抗体(1∶400，Cell Signaling公司)，4 ℃孵育过夜，37 ℃复温30 min；滴加生物素偶联的羊抗兔IgG抗体；37 ℃孵育30 min；加HRP标记的链亲和素，37 ℃孵育30 min；DAB显色，苏木素复染，中性树脂封片。以PBS替代一抗后作为阴性对照，阳性时呈棕黄色。 1.6 gCl2(25 mmol·L-1)、1 μl Oligo dT、2 μl dNTPs(10 mmol·L-1)、0.25 μl RNase inhibitor、1 μl AMV逆转录酶(TaKaRa公司)、2.75 μl总RNA，30 ℃10 min后42 ℃逆转录50 min，99 ℃灭活逆转录酶5 min，5 ℃ 5 min，所得cDNA-20 ℃保存用于PCR扩增。 1.7.3 PCR扩增 JNK及GAPDH内参照引物用DNA Club软件设计，由上海Invitrogen公司合成，序列见表1。表1 目的基因上下游引物及其扩增片段长度 PCR反应体系为:5×PCR缓冲液10 μl、MgCl2(25 mmol·L-1)4 μl、dNTPs(10 mmol·L-1)1 μl、上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μl、cDNA模板1 μl、TaqDNA聚合酶 (5 U·μl-1)(TaKaRa公司)0.25 μl，补足双蒸水至50 μl。Eppendorf AG 22331 PCR扩增仪扩增。96 ℃预变性3 min；96 ℃变性30 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，循环38次；72 ℃终末延伸10 min。 1.7.4 产物检测 扩增产物在含0.5 mmol·L-1溴乙锭的1%琼脂糖凝胶中以4～5 V·cm-1电压降电泳30 min。于Image Master VDS凝胶扫描仪上成像,用Totallab V 2.01凝胶图像分析软件进行半定量分析。所有JNK产物的吸光度均以GAPDH为基准较正,以JNK /GAPDH表示。 1.8 统计学处理 计数资料以x-±s表示，各组之间比较采用多因素方差分析或秩和检验，相同时间点两组之间采用t检验或秩和检验，采用SPSS 13.0统计软件进行处理，Plt;0.05为差异具有统计学意义。 2 结 果 2.1 24 h尿蛋白定量结果 12周与16周模型组小鼠24 h尿蛋白总量均显著高于相应正常对照组小鼠(Plt;0.01)，16周模型组小鼠24 h尿蛋白总量与12周模型组比较差异具有统计学意义(Plt;0.05)，见表2。表2 各组小鼠24 h尿蛋白检查结果 1）与正常对照组比较，Plt;0.01；2）与12周模型组比较，Plt;0.05 2.3 免疫组织化学染色结果 2.3.1 肾组织中JNK表达变化 12周及16周正常对照组小鼠肾小球脏层上皮、近端及远端肾小管均有少量JNK表达；12周模型组小鼠肾小球系膜细胞、内皮细胞、脏层上皮细胞及肾小管间质中阳性细胞数目增加，阳性表达颜色加深；16周模型组小鼠肾组织中JNK表达更加明显。见图1。 A.12周正常对照组；B.12周模型组；C.16周正常对照组；D.16周模型组 图1 各组小鼠肾组织JNK蛋白免疫组织化学染色结果 DAB显色×400 2.3.2 肾组织中pJNK表达变化 12周及16周正常对照组小鼠仅肾小管间质有极少量的pJNK表达；12周模型组小鼠肾组织pJNK主要表达在肾小球系膜细胞、内皮细胞、脏层上皮细胞及近端和远端肾小管，16周模型组小鼠肾组织pJNK表