反义caveolin1对实质肿瘤细胞中β3半乳糖基转移酶7表达的调节作用.doc

　　反义caveolin1对实质肿瘤细胞中β3半乳糖基转移酶7表达的调节作用 【关键词】 β3半乳糖基转移酶7； caveolin1； 反义核苷酸； 肿瘤细胞 　　［Abstract］ Objective: To research the modulation of the doan parenchyma tumor cells.Methods： By means of the transfection to transfect the ASOND to four parenchyma tumor cells to detect the expression of β3GalT7. Results： The expression of β3GalT7 had been raised in the four cells after transfection of ASODN. Conclusion： Caveolin1 had a minus relationship or cells 　　多种肿瘤(如前列腺、乳腺、口腔等的肿瘤)的发生均与染色体7q31.1区内染色体缺失有关,编码caveolin1的基因就位于7q31.1,推测caveolin1可能对正常细胞的恶性转化和恶性增殖有抑制作用。caveolin1由Clenney等发现,相对分子质量21 000～24 000,长178AA,其编码基因定位于7q31.1,有3个外显子。caveolin1与细胞的恶性转化、恶性增殖、侵袭、转移以及信号传导有关,逐渐受到人们关注。多数事实支持caveolin1是一种抑制肿瘤蛋白。用反义caveolin1致使caveolin1表达下调,并使NIH3T3细胞发生转化，caveolin1表达显著降低［1］。I1640完全培养基：每升RPMI1640基础培养基（Gibco，美国）中，添加小牛血清100 ml，L谷氨酰胺0.292 g，NaHCO3 2.0 g，葡萄糖3.6 g，HEPES（Amresco，进口分装 ）2 g；胰蛋白酶购自Sigma公司；DEPC购自上海华舜生物工程公司；Oligo(dT)，Trizol，RNase Inhibitor，Suoercript IIRNase H Reverse transcriptase，Taq DNA聚合酶，dNTP Mix（10 mmol/L），10×PCR 缓冲液，MgCl2（25 mmol/L）购自Promega公司；琼脂糖，Mix DNA 标准参照物购自南京大治公司；Liprofectamine 2000购自Invitrogen公司。β3GalT7多克隆抗体由本实验室制备，MMP2抗体购于Sigma公司。 　　1.2 反义核苷酸的人工合成 　　caveolinl反义核苷酸序列为5′ATGTCCCTCCGAGTCTA3′，经基因库同源性检测，未发现与人类其他基因序列有同源性，命名为CAV1。反义核苷酸序列由南京基天生物工程公司合成，全部碱基硫代磷酸型,在5′端用绿色荧光蛋白FITC标记，PAGE 纯化，冻干分装， -20 ℃保存，应用时以无菌双蒸水溶解。以反义核苷酸打乱顺序序列5′ATCACCGTCGGTCTCTAT3′作为阴性对照，命名为CAVD。 　　1.3 寡核苷酸转染细胞 　　将处于对数生长期的4种肿瘤细胞接种于培养瓶(1×106/ml),于37℃ 5%CO2培养箱中温育12 h后,按2 000介导转染贴壁细胞的方法,将反义核苷酸和阴性对照转染入细胞，48 h后收集。 　　1.4 荧光成像系统观测 　　将细胞置于荧光显微镜下,激发光波长为507 nm观察。 　　1.5 细胞收集培养 　　人喉癌细胞株Hep2，人肺腺癌细胞株A549，人肝癌细胞株HepG2，人胃癌细胞株SGC7901单层培养于 37 ℃，5 %CO2饱和湿度培养箱中，采用0.25%胰酶消化，以消化传代后处于对数生长期的细胞备用。 　　1.6 RTPCR 　　分别收集这4种细胞株对数生长期的细胞，进行反转录PCR分析。以βactin为内对照,分别检测4种细胞caveolin1和β3GalT7的mRNA表达水平。选用βactin为内对照,以总RNA的RT产物为模板同时进行PCR扩增,PCR反应条件是94℃预变性4 min,94℃变性50 s,59℃退火50 s,72℃延伸90 s,32个循环,72℃再延伸10 min。设计引物采用Geyx软件,并经基因库Blast进行同源检索后合成。引物由Invitrogen公司合成。 　　1.7 蛋白质印迹检测肿瘤相关指标 　　用蛋白质印迹(按分子克隆操作,化学显色法显示杂交条带,洗片机洗片，数码相机拍照记录