口蹄疫病毒VP1基因重组腺病毒的构建与鉴定.docVIP

　　口蹄疫病毒VP1基因重组腺病毒的构建与鉴定 ：苏春霞， 段相国， 张艳丽， 摆茹， 陈溥言 【摘要】 目的 构建表达O型口蹄疫病毒( Foot-and-Mouth disease Virus，FMDV)VP1基因的重组腺病毒并对其进行鉴定。方法 将FMDV VP1基因克隆到腺病毒的穿梭载体pAdeno Vator-CMV5-IRES-GFP中。得到的阳性穿梭质粒经PmeⅠ酶线性化后，利用电转化技术将线性化的阳性质粒与腺病毒骨架载体pAdeno VatorΔE1/E3共转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使其在大肠杆菌中进行同源重组。将筛选到的重组病毒质粒经PacⅠ酶线性化后暴露出包装信号，通过脂质体LipofectamineTM2000转染HEK-293A细胞后得到重组病毒。利用报告基因GFP和细胞病变检测重组病毒滴度和感染效率，通过PCR和L。eⅠ、PacⅠ购自Gene公司，其他限制性核酸内切酶、连接酶、聚合酶、牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)，核酸分子量标准，DNA小量凝胶回收试剂盒均购自大连TaKaRa公司。LipofectamineTM2000购自上海Invitrogen公司，DV 的标准阳性血清为 中国 农业 科学 院兰州兽医研究所产品。 　　1.2 方法 　　1.2.1 转移载体pA5-VP1的构建 以pMD18-VP1为模板，重新设计扩增VP1基因的1对引物(上海Invitrogen公司合成)。 　　P1:5’-CGTAGATCTATGACCACCTCA-3’ (BglⅡ) 　　P2:5’-GCAGATCTCTCGAGTCAAAAAGCTGTTT-3’ (BglⅡ，XhoⅠ) 　　PCR产物和穿梭载体pAdeno Vator-CMV5-IRES-GFP分别经BglⅡ酶切，并于4 ℃过夜连接，氯化钙法转化大肠杆菌DH5α。提质粒用XhoⅠ进行酶切鉴定其正反向。将获得的阳性重组质粒命名为pA5-VP1，送上海Invitrogen公司测序。 　　1.2.2 pA5-VP1在大肠杆菌BJ5183中与pAdeno VatorΔE1/E3的同源重组 取1 μL(约100 ng)纯化的骨架载体pAdenoVatorΔE1/E3和5 μL(约1 μg)经PmeⅠ线性化的转移质粒pA5-VP1在1个灭菌的离心管中混合;电转化入感受态大肠杆菌BJ5183中(电转化仪的参数设置为：2.5 kV，25 μF，200 Ω)，使其在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组。获得疑似重组腺病毒质粒用PacⅠ进行酶切鉴定，将阳性重组腺病毒质粒分别命名为pAd5-VP1。 　　1.2.3 重组腺病毒质粒转染HEK-293A细胞 按碱裂解法大量提取质粒pAd5-VP1并经PEG沉淀法纯化质粒DNA，经PacⅠ线性化，切除部分质粒构件，暴露出末端反转重复序列。按照LipofectamineTM2000说明书转染HEK-293A细胞，同时转染pAdeno VatorΔE1/E3载体对照。由于pA5-CMV5-IRES-GFP系统在细胞内可以表达绿色荧光蛋白(GFP)，转染后的12～24 h在荧光倒置显微镜下观察荧光来判断目的基因是否表达，如果观察到荧光，继续培养7～10d，每天观察荧光和细胞病变(CPE)。当出现明显的细胞病变效应时，将细胞回收，-80℃冻存。 　　1.2.4 重组病毒的纯化、鉴定及TCID50的测定 利用无限稀释法进行纯化。具体方法：在96孔细胞培养板上，每孔接种5×104个HEK-293A细胞，至80%密度时，在无血清培养液中感染病毒。重组病毒按连续10倍梯度稀至10-10，每个稀释度接种8个孔，并设立空白对照。感染1～2h换成细胞培养维持液。通过观察噬斑的形成过程，选取单噬斑孔细胞进行扩大培养。阳性重组腺病毒经PCR和D18-VP1为模板，用引物P1、P2扩增出大小约639 bp的条带，结果如图1。 　　1-3.VP1的PCR扩增结果;M.DL2000 　　图1 VP1基因的PCR扩增 　　2.1.2 转移载体的构建 在pA5-CMV5-IRES-GFP载体BglⅡ酶切位点的上游350 bp处有一个XhoⅠ位点，此位点也是载体上单一的酶切位点。在扩增目的基因的下游引物上设计一个XhoⅠ位点，将构建的转移载体用XhoⅠ单酶切来鉴定目的基因是否插入载体中，并鉴定插入方向是否正确，如果目的基因正向插入载体中，酶切后可出现1kd左右的酶切片段，结果如图2。 　　2.2 同源重组腺病毒质粒pAd5-VP1的线性化鉴定 在大肠杆菌BJ5183中筛选的重组病毒质粒，用PacⅠ单酶切，在0.7%的琼脂糖凝胶电泳中出现两条带：分别为35 kb和4.5 kb，如图3。将阳性重组病毒质粒分别命名为pAd5-VP1。 　　2.3 重组病毒的产生 　　2.