多用途基因捕获C3H-10T1-2细胞阳性克隆库的构建及鉴定.doc

　　多用途基因捕获C3H/10T1/2细胞阳性克隆库的构建及鉴定 【摘要】 　　目的： 以10T1/2细胞为间充质干细胞模型，构建用于间充质干细胞分化及恶性转化分子机制等研究的基因捕获阳性克隆库. 方法： Dra I线性化逆转录病毒基因捕获载体ROSAFARY后，与pIRES2-EGFP用脂质体共转染phoenix细胞，LacZ染色证明转染成功后收集病毒上清感染10T1/2细胞. 经潮霉素筛选获得阳性克隆，为排除假阳性克隆用LacZ部分片段PCR进行鉴定. 结果： ROSAFARY脂质体转染phoenix细胞后48 h，GFP指示的转染效率约为20%～30%，LacZ染色有大约10％的阳性率. 150 mg/L潮霉素筛选病毒感染的10T1/2细胞，挑取药物抗性克隆，PCR鉴定后获得43个阳性克隆，LacZ染色5个为捕获基因高表达细胞克隆. 结论： 基因捕获技术建立非胚胎干细胞的克隆是可行的，成功建立的基因捕获阳性克隆库为应用基因捕获技术揭示成体干细胞分化及恶性转化分子机制奠定了基础. 【关键词】 基因捕获 C3H/10T1/2细胞 聚合酶链反应R β-半乳糖苷酶类 　　【Abstract】 AIM： To construct a library of gene trapped clones based on rosafary-transfected C3H/10T1/2 cell line in order to provide a ne for study of the mechanism of differentiation or malignant transformation of mesenchymal stem cells. METHODS： Retroviral gene-trap vector,ROSAFARY,ine. The retrovirus particles containing gene-trap construct ic PCR targeting LacZ sequences in ROSAFARY vector ed to further identify the drug-resistant 10T1/2 clones. RESULTS： At 48 h after the transfection,GFP co-transfection indicated that the transfection efficiency reached 20%～30% and about 10% of positive LacZ staining ycin selection g/L,total 43 clones ed by PCR,including 5 clones oter activity of trapped gene. CONCLUSION： It is feasible to construct a library of gene trapped clones by gene trap technique in cells other than embryonic stem cells and the library provids a ne for screening genes related cell differentiation and malignant transformation. 　　【Keyerase chain reaction;beta-galactosidase 　　0 引言 　　干细胞由于具有高度自我更新和多向分化潜能的优势成为近年基础及临床研究的热点，但其向某一特定途径分化，形成特定类型组织细胞及发生恶性转化的机制至今仍不清楚. 如何确认干细胞分化及恶性转化机制，既需要实验结果的积累，更需要技术方法的突破. 基因捕获是一种简便而高效的解析基因功能的新方法. 该方法通过随机插入突变后报告基因的表达揭示突变内源基因的功能［1］. C3H10T1/2细胞(简称10T1/2细胞)是Reznikoff等［2］从C3H小鼠分离建立的间充质干细胞株，可分化为骨［3］、软骨［4］、脂肪［5］、肌［6］和内皮细胞［7］，射线和化学诱导剂可使其恶性转化. 本实验将10T1/2细胞作为间充质干细胞模型，用LacZ为报告基因的PolyA基因捕获载体ROSAFARY转染10T1/2细胞，建立为应用基因捕获技术研究间充质干细胞分化及恶性转化分子机制的基因捕获阳性克隆库. 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 大肠杆菌E. coli. DH5α，质粒pIRES2-EGFP由本所保存. RV包装细胞phoenix由本校生化教研室惠赠. 10T1/2细胞购自ATCC细胞库