小鼠B7H4原核表达载体的构建、表达及多克隆抗体的制备.doc

　　小鼠B7H4原核表达载体的构建、表达及多克隆抗体的制备 ：肖德乾，肖欢，胡国艳，那志萍，郑淑华，刘伟，张良清，徐军发 【摘要】 目的 探讨小鼠B7H4原核表达载体的构建、表达及多克隆抗体的制备。方法 采用特异性引物扩增小鼠B7H4（mB7H4）胞外功能区DNA，经酶切、拼接构建原核表达载体pET28amB7H4。将构建的重组表达质粒转化入E.coli BL21 (DE3)菌株，采用IPTG诱导表达、NiNTA柱亲和层析纯化目的蛋白、SDSPAGE分析蛋白纯度。将纯化的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体，并对其进行纯化及鉴定。结果 序列测定证实了构建的pET28amB7H4重组表达载体含有mB7H4编码序列，其序列分析与GenBank中公布序列对比一致，质粒在E.coli中诱导表达相对分子质量(Mr)为26.5 KD的目的蛋白，SDSPAGE分析表明纯化后的目的蛋白达到电泳纯。双向琼脂扩散法检测抗体效价为1∶16，ELISA法检测抗体效价为1∶12 800，ethods Murine B7H4 (mB7H4)gene plified ers. The PCR product es and then ligated to reconstruct rebinant prokaryotic expression vector pET28amB7H4 that expresses the mouse B7H4 and 6 His fusion protein. The expression vector ed into E.coli BL21 (DE3) and induced B7H4 fusion protein that and analyzed ed that this rebinant expression vector contained mB7H4 coding sequence that id expressed a 26.5kD protein. After purified , the resulted protein onstrated that the antimB7H4 antibody bound specifically to mB7H4.Conclusion The prokaryotic expression vector and the antiserum for mB7H4 　　B7H4（B7x，B7S1）是T细胞活化的共抑制分子（coinhibitor），其mRNA广泛表达于淋巴样和非淋巴样组织（如肺、睾丸、胰腺、前列腺），但其蛋白质在各种组织中不表达或低表达，而在树突状细胞（DC）、单核细胞、巨噬细胞、B细胞和T细胞表面诱导性表达［14］。跨膜型B7H4和可溶性B7H4Ig融合蛋白均可抑制T细胞活化［15］，提示B7H4可能在维持机体自身耐受方面起重要作用。目前，国内对B7H4基因原核表达的研究相对较少，我们在克隆了小鼠B7H4（mB7H4）基因的基础上［6］构建表达mB7H4His融合蛋白的原核表达载体pET28amB7H4，并制备兔抗mB7H4多克隆抗体，为进一步研究B7H4的生物学功能奠定了基础。 　　 1 材料和方法 　　1.1 动物、质粒和菌株 　　大肠杆菌DH5a和BL21 (DE3)均为本实验室保存。pGEMTmB7H4载体由本实验室构建［6］，pET28a(+)表达载体购于Novagen公司。成年新西兰家兔（2kg/只）由广东医学院实验动物中心提供。 　　1.2 试剂 　　质粒抽提和胶回收试剂盒购自Invitrogen（上海）公司，限制性内切酶购于NEB公司，T4 DNA连接酶购自Promega公司，Taq酶购于TaKaRa生物工程公司，DNA Marker和蛋白质Marker购于天根生化科技有限公司，镍离子金属螯合柱(NiNTA)购自Invitrogen（美国）公司，HRP标记的羊抗兔IgG购自北京博奥森生物技术公司，PVDF膜为美国PALL公司产品。DNA合成和测序由Invitrogen（上海）公司完成。常规试剂为国产分析纯。 　　1.3 载体构建 　　采用PCR技术，自pGEMTmB7H4载体中扩增除mB7H4的胞外段，引物序列为Sense：5GTT TTC CCA TGG GCA TTT CAG GCA AGC ACT TC3，Antisense：5 GTT TTC CTC GAG GGA GTT CAG CAA CTG CAG CTG3，在引物的5端分别插入NcoI和XhoI限制性内切酶位点，PCR产物长度为699 bp。酶切