小鼠PDL1Red2融合蛋白真核表达载体的构建、 表达及其效应.doc

　　小鼠PDL1Red2融合蛋白真核表达载体的构建、 表达及其效应 ：廖雯君, 孙晶, 朱慧芬, 张金元, 沈关心 【摘要】 目的: 小鼠跨膜型PDL1与红色荧光蛋白（RFP）融合基因真核表达载体的构建、 表达与鉴定, 及其效应初步研究。方法: 应用基因工程技术构建重组载体, 脂质体转染NIT细胞株, 以流式细胞术（FCM）和倒置相差荧光显微镜检测融合蛋白的表达; 采用混合淋巴细胞培养, 以FCM测定脾细胞的增殖反应。结果: 融合基因在转染的真核细胞中获得表达, 并呈膜分布, 转染PDL1/pDsRed2N1的细胞对淋巴细胞增殖反应有一定的抑制作用, 表明PDL1/pDsRed2N1融合蛋白中分子标签未影响PDL1的结构及其生物学活性。结论: PDL1与DsRed2融合基因载体构建成功, 表达的融合蛋白具有生物学活性。 【关键词】 PDL1; 红色荧光蛋白; 融合基因; 混和淋巴细胞培养 B7家族的共刺激分子无论在提供共刺激信号或抑制性信号中均起关键作用［1］。PDL1(PD ligand1) 又称B7 DC, 是B7家族的新成员［2］, 主要表达在树突状细胞、 单核/巨噬细胞、 B细胞、 激活的T细胞。某些恶性肿瘤细胞系亦有表达, 可能与肿瘤免疫逃避机制相关［3］。PDL1既能促进T细胞增殖也能抑制T细胞活化［4］, 其受体为程序死亡蛋白1(programmed death 1, PD1), 诱导性表达于T细胞表面, PD1/PD L1信号在免疫应答的负性调控中发挥重要作用［5］。 红色荧光蛋白（DsRed2）于香菇珊瑚体内, Matz等［6］等将原红色荧光蛋白DsRed经过点突变之后的突变体, 溶解性增强, 表达时间缩短。本实验采用逆转录－多聚酶链反应（RTPCR）方法, 克隆了跨膜型PDL1, 并与红色荧光蛋白融合, 构建真核表达载体pDsRed2N1/PDL1, 用脂质体转染将其导入胰岛细胞（NIT）中, 并观察其表达及其对淋巴细胞增殖影响, 为进一步研究PDL1的生物学效应及其应用奠定基础。 1 材料和方法 1.1 材料 E.coli DH5α、 pDsRed2N1由华中科技大学同济医学院免疫学系保存。pMD18T质粒、 DNA marker DL 2 000均购自TaKaRa公司。小鼠胰岛β细胞株（NIT）, 由澳大利亚 first strand cDNA Synthesis kit、 dNTPs及DNA Extraction kit均为MBI公司产品。TRIzolTM Reagent kit、 LipofectamineTM2 000、 VybrantTMCFDA SE Cell Tracer kit(V12883)均购自Invitrogen公司。丝裂霉素C、 ConA均购自Sigma。Biotin抗鼠PDL1抗体购自eBioscience公司。streptridinAPC为BD公司产品。 1.2 方法 1.2.1 组织总RNA的提取 将BALB/c孕鼠麻醉处死后, 仰卧位, 解剖取出胎盘、 肾脏、 子宫、 心脏、 肌肉等组织, 分别置入少量液氮快速研磨。将组织转移到EP管, 采用TRIzol提取RNA, 紫光分光光度计测定其纯度和浓度, 分装后于-80℃中保存待用。 1.2.2 跨膜型PDL1 cDNA的RTPCR扩增 根据GenBank中鼠PDL1 cDNA序列及 参考 文献 ［1］设计引物, 上游引物P1: 5′CAAGTAGACAAGCTTCCACCATGAGGATATTTGCT3′, 下游引物P2: 5′CGTTCGTCGACTGCGTCTCCTCGAATTG3′, 由上海英俊(Invitrogen)生命合成。以4 μg RNA为模板, 以50 pmol/L下游引物P2引导, 按RevertAidTM first strand cDNA Synthesis kit说明书合成PDL1的第1链, 反应体积20 μL。取5 μL逆转录反应液为模板, 加引物P1、 P2, Taq DNA聚合酶等PCR扩增PDL1全长cDNA。 1.2.3 扩增片段的克隆、 筛选 将PCR产物直接连接pMD18T载体16℃, 水浴过夜后, 转化E.coli DH5α感受态细胞。采用菌落PCR筛选接入正确外源基因的转化子PDL1/pMD18T, 以碱裂解法从阳性克隆中提取质粒, 双酶切鉴定, 用ABI3730测序仪测定序列。同时用Sal I、 Hind III 过夜酶切PDL1/pMD18T和pDsRed2N1, 10 g/L琼脂糖凝胶电泳分离回收900 bp和5.7 kb片段, 用T4连接酶连接过夜, 转化E.coli