慢性苯中毒患者外周血TCR Vδ亚家族T细胞分布和克隆性研究.doc

　　慢性苯中毒患者外周血TCR Vδ亚家族T细胞分布和克隆性研究 ：李萡, 李扬秋, 陈少华, 杨力建, 余卫, 刘薇薇, 陈嘉榆 【摘要】 　　目的: 了解慢性苯中毒患者外周血T细胞的TCRVδ基因谱系及其克隆性增殖情况。 方法: 利用RTPCR方法扩增10例慢性苯中毒患者外周血单个核细胞中8个TCR Vδ基因的互补决定区3(CDR3), PCR产物进一步经荧光标记和基因扫描分析CDR3长度而确定T细胞的克隆性。结果: 8例健康人平均表达（6.63±0.52）个Vδ亚家族, 外周血中未检测到Vδ4和Vδ5亚家族, 慢性苯中毒患者工人表达（1.10 ±0.57）个Vδ亚家族（1例重度苯中毒工人8个Vδ亚家族均未表达）, 外周血中未检测到Vδ1、 Vδ3、 Vδ4和Vδ8亚家族, 与健康人比较有显著性差异（Plt;0.01）。6例慢性苯中毒患者存在1～2个Vδα亚家族T细胞出现克隆性增殖。结论: 慢性苯中毒患者外周血出现TCR Vδ亚家族倾斜性分布和克隆性增殖T细胞, 这可能是苯中毒后所引起的机体特异性免疫反应。 【关键词】 苯 TCR Vδ基因 克隆性T细胞 　　苯是目前应用最为广泛的化工原料和 工业 溶剂之一。有关慢性苯中毒以及接苯所致再生障碍性贫血（AA）, 骨髓增生异常综合征（MDS）和白血病确切发病机制仍不明确［1］。多项研究已表明苯及其代谢物抑制T细胞的增殖而损伤机体细胞免疫功能, 人外周血T细胞主要表达TCRαβ+T细胞（90%以上）, 我们前期工作发现苯接触人群和苯中毒患者的外周血TCRVα, Vβ亚家族T细胞表达和克隆模式发生改变［2, 3］, 提示苯对T细胞免疫可能存在的损伤。尽管外周血中仅存在少量的TCRγδ+T细胞, 但对机体细胞免疫功能同样举足轻重。通过分析慢性苯中毒患者外周血T细胞中TCRVδ基因各亚家族细胞的分布和克隆性增殖情况可以更为全面地了解慢性苯中毒患者 T 细胞的免疫功能变化。 　　 1 材料和方法 　　1.1 材料 慢性苯中毒患者外周血标本10例, 其中男4例、 女6例, 年龄20～48岁, 平均年龄（30.5±8.6）岁, 工龄1.0～14.0年, 平均(8.4±5.6)年; 健康人外周血标本8例, 其中男5例、 女3例, 年龄24～40岁, 平均年龄（30.8±6.2）岁, 慢性苯中毒患者标本由广州市第十二人民 医院 提供, 健康人外周血标本于本试验室工作人员。慢性苯中毒患者均有职业接苯史, 慢性苯中毒患者和健康人均无影响造血和免疫功能的基础疾患、 首次就诊3个月内未使用影响造血和免疫功能的药物、 无癌症史、 放疗及化疗史、 无其他骨髓毒性化学物接触史和放射线接触史。10例慢性苯中毒患者中含5例慢性轻度苯中毒（编号B1～5）、 5例慢性重度苯中毒（含再生障碍性贫血2例, 编号B6～10）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 RNA提取和cDNA合成 RNA提取应用TRIzol试剂盒（Invitrogen, USA）并应用随机引物和反转录酶试剂盒（Po引物作为标记PCR产物和基因扫描之用。引物均由德国柏林 TIB MOLBIOL公司合成（表1）［4］。 　　表1 用于 TCR Vδ 基因检测的引物序列（略） 　　1.2.3 PCR扩增PCR 按已报道的方法进行［5］。总反应体积为20 μL, 其中含1 μL cDNA、 任一Vδ引物（8 个Vδ引物之一）和Cδ引物（0.5 μmol/L）、 0.1 mmol/L dNTP、 1 U Taq聚合酶（Promega, USA ）、 1.5 mmol/L Mgcl2和10×PCR缓冲液。反应在PCR扩增仪（Biometra, Germany）中进行, 共进行40循环, 每一循环包括: 94℃ 1 min（首次3 min）, 60℃ 1 min 和72℃ 1 min（末次6 min）, PCR 产物保存于4℃中备用。 　　1.2.4 T细胞克隆性分析 10 μL 的反应体系含 2 μL 的未标记的PCR产物、 0.1 μmol/L Cδfam 引物、 1.5 mmol/L MgCl2, 0.2 mmol/L dNTP, 1 U Taq聚合酶和PCR缓冲液。PCR共进行35循环, 退火温度为66℃, 余同上。取2 μL荧光素Fam标记的PCR产物加入高质量的去离子甲酰胺（HiDi Formamide, ABI）与标准品(Perkin Elmer GENESCANTM500LIZTM, ABI, 其中含有荧光素LIZ标记的不同大小的DNA片段)按20∶1比例配好的10 μL混合液, 94℃变性4 min, 然后将样品加入96孔板, 直接装载到已灌好POP4（Performance Optimized Polymer4, A