抗11β羟类固醇脱氢酶1的单克隆抗体的制备与鉴定.doc

　　抗11β羟类固醇脱氢酶1的单克隆抗体的制备与鉴定 ：王婉, 杨金菊, 刘莉, 陈志成, 高媛, 高建恩, 安立国, 孙启鸿 【摘要】 　　目的: 制备抗人11β羟类固醇脱氢酶1（homo sapiens hydroxysteroid 11beta dehydrogenase 1, HSD11B1）的单克隆抗体（mAb）并初步鉴定其特性。方法: 将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体, 用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠, 采用杂交瘤技术制备mAb, 并通过间接ELISA法、 r)为35000的蛋白; 应用mAb CBF245对人肝脏cDNA表达文库（UniZAP XR）进行筛选, 阳性噬菌斑测序结果显示5个阳性克隆插入序列均为HSD11B1。结论: mAb BAD062特异地识别抗原HSD11B1, 该mAb可用于ELISA检测、 : To generate and identify monoclonal antibodies (mAb) against homo sapiens hydroxysteroid 11beta dehydrogenase 1 (HSD11B1). METHODS: Normal human liver tissues ogenized, and mitochondria itochondrial proteins munize BALB/c mice to generate mAb by hybridoma technique. The mAb munohistochemistry. The antibody specificity munoprecipitation (IP), and confirmed by UniZAP expression library screening. RESULTS: One hybridoma CBF245 secreting specific mAb against HSD11B1 Ab munohistochemistry. Our data shoAb , olecular itochondria of human liver tissue. The CBF245 mAb ed by immunoscreening of UniZAP XR liver cDNA expression library. CONCLUSION: A hybridoma cell line stably secreting specific mAb against HSD11B1 is established and characterized. This mAb reacted munohistochemistry assay, IP, and Ab; mitochondria 　　11β羟类固醇脱氢酶1（homo sapiens hydroxysteroid 11beta dehydrogenase 1, HSD11B1）属于短链脱氢/还原酶蛋白超家族(SDR), 为相对分子质量(Mr)为34000的糖蛋白。此酶主要以糖基化的形式存在于微粒体, 其作用依赖于辅酶NADP, 在体内负责活性的糖皮质激素向其无活性前体的转换, 调节局部糖皮质激素浓度, 并决定糖皮质激素流向其受体[1]。代谢综合征糖皮质激素敏感性增加, HSD11B1调节异常, 可能是肥胖、 糖耐量低减、 高血压和心血管疾病等代谢综合征重要发病机制之一, 选择性HSD11B1抑制剂有望成为其 治疗 靶点。HSD11B1在体内广泛表达, 多分布于肝、 肺、 脂肪组织、 脉管系统、 卵巢及中枢神经系统。我们在成人肝脏线粒体单克隆抗体(mAb)库的建立中, 应用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠制备mAb, 其中1株为鼠抗人HSD11B1 mAb, 并对其特异性进行了鉴定, 为进一步研究HSD11B1的作用奠定了基础。 　　 1 材料和方法 　　1.1 材料 免疫和筛选用成人肝组织线粒体总蛋白, 由本室制备; 弗氏佐剂为Sigma公司产品; 羊抗鼠IgGHRP为中山公司产品; 蛋白酶抑制剂为Roche公司产品; BCA蛋白定量试剂盒为Pierce公司产品; cDNA 表达文库为美国Stratagene公司产品; PVDF膜、 ECL反应试剂盒均为Amersham公司产品; DY89Ⅱ型电动玻璃匀浆机构自宁波新芝生物科技股份有限公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 成人肝组织线粒体总蛋白抗原的制备 成人肝组织匀浆700～750 r/min, 10 g组织加40 mL匀浆缓冲液800 g离心10 min, 取上清, 10000 g离心10 min, 沉淀即为线粒体, 用匀浆缓冲液洗2次[