穴位埋药线对癫痫持续状态后神经细胞凋亡的抑制作用.doc

　　穴位埋药线对癫痫持续状态后神经细胞凋亡的抑制作用 ：陈文华，庄礼兴，丁晓虹 【关键词】 穴位埋药线 　　摘要：【目的】探讨穴位埋药线法抑制癫痫持续状态(SE)后大鼠海马神经元凋亡的基因水平机制。【方法】以腹腔注射青霉素诱导大鼠SE，采用免疫组织化学法检测SE后大鼠海马神经元凋亡相关基因cjun、bcl2的表达。【结果】青霉素致SE后24h，穴位埋药线组、苯妥英钠组和常规针刺组与模型组比较，cjun表达降低，bcl2表达升高，两者分别与细胞凋亡指数(AI)呈正、负相关，其中以穴位埋药线组与模型组差异最为显著。【结论】提示穴位埋药线疗法可能通过抑制cjun、促进bcl2蛋白表达，阻止SE后大鼠海马神经元凋亡的发生发展，从而起治疗癫痫的作用。 　　关键词：癫痫持续状态／穴位疗法；神经元；基因，cjun；基因，bcl2； 疾病模型，动物；大鼠 　　癫痫反复发作引起的神经细胞死亡有死亡和凋亡两种形式。细胞凋亡是涉及一系列基因的激活、表达以及调控的过程［1］。与癫痫发作后细胞凋亡密切相关的基因有即早基因cjun、癌基因bcl2等。本研究主要通过检测SE后大鼠海马神经元凋亡相关基因cjun、bcl2的表达，探讨穴位埋药线疗法抑制SE后大鼠海马神经元凋亡的基因水平机制。 　　1 材料与方法 　　11 主要试剂与器材 　　苯妥英钠片剂，100mg／片，批号：020432；青霉素针剂，40万U／支，批号：U0205002，均为华北制药厂生产。细胞凋亡原位末端标记(Tunel法)检测试剂盒，批cjun一抗，批号：2870702；bcl2一抗，批号链霉菌抗生物素蛋白―过氧化酶(SP)试剂盒，批号：030408；联苯二胺(DAB)显色试剂，批号以上试剂均购自北京中山生物技术有限公司。常规针刺组根据实验大鼠体型以美容针代替成人用针灸针进行操作。 　　12　动物分组与造模 　　健康纯系雄性SD大鼠40只，体重160～180g，由广州中山大学北校区实验动物中心提供(粤检证字2002A075)，随机分成空白组、模型组、苯妥英钠组、常规针刺组、穴位埋药线组，每组8只。除空白组外，其他4组动物以青毒素400万U／kg腹腔注射，复制癫痫持续状态(SE)模型［2-3］；空白组腹腔注射与模型组同等剂量的1539mmol／L温生理盐水。 　　模型评价：以大鼠出现行为和皮质脑电图改变视为造模成功。 　　①行为改变：大鼠的癫痫发作按Racine法［4］分为5级：Ⅰ级为口角和面部抽动；Ⅱ级为Ⅰ级+点头；Ⅲ级为Ⅱ级+前肢阵挛；Ⅳ级为Ⅲ级+后腿站立；Ⅴ级为Ⅳ级+跌倒。以大鼠出现Ⅳ～Ⅴ级发作，且持续20min以上为合乎标准。 　　②皮质脑电图改变：大鼠皮质脑电图出现痫性放电。 　　13 治疗方法 　　苯妥英钠组在致痫时给药；常规针刺组在造模前5d和致痫时均予以治疗，每天1次；穴位埋药线组在造模前3d埋线。①穴位埋药线组：选取大鼠穴位方法参照《实验针灸学》，取大椎、心俞透膈俞(双)。用长约5cm的00号医用羊肠线浸泡于安定液(含量5g／L)24h后备用；操作方法：穴位处剪毛，用龙胆紫作出标记，皮肤常规消毒，在标记中用20g／L利多卡因皮内麻醉，镊取一段约05cm长的药线，放置在6号注射针头的前端，后接针芯(28号15寸长的毫针剪去针尖)，左手拇、食指绷紧或捏起进针部位皮肤，右手持针，刺入到所需深度后，边推针芯，边退针管，将药线埋植在穴位的皮下组织或肌层内，针孔处用消毒棉签按压片刻。②常规针刺组：选大椎、心俞透膈俞(双)，用美容针，留针30min，期间加以平补平泻手法，每天1次。③苯妥英钠组：致痫后即予腹腔注射025mg／kg苯妥英钠。 　　14 指标检测 　　所有动物均在模型组致痫24h后麻醉，经40g／L多聚甲醛心脏灌注固定，断头取脑，标本常规脱水、浸蜡、包埋后，冠状连续石蜡切片(片厚4μm，以镜下所见相同海马切面形态为统一切片深度标准)。 　　141 原位细胞凋亡检测法(AP法) 　　检测穴位埋药线对SE后大鼠海马神经元DNA片段化的影响：预加热切片至60℃，常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇入水；室温下001mol／L(pH60)柠檬酸钠Triton X100孵育8min，PBS漂洗2次；加50μL标记混合物，41℃水浴箱孵育1h，PBS漂洗2次；加50μL转换液41℃水浴箱孵育30min，PBS漂洗3次；加50μL5溴4氯3吲哚磷酸二钠盐(BCIP)显色液显色10min，PBS漂洗3次；封片后观察结果；用已知阳性片作为阳性对照，用PBS替代一抗作阴性对照，细胞核中有紫或深蓝色颗粒者为阳性染色细胞。每张切片计数3个不同视野(400×)内的阳性细胞数，取平均数作为细胞凋亡指数(apopt