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蛋白质的定性测定 考马斯亮蓝法 该染料和蛋白质是通过范德华力结合的。考马斯亮蓝含有较多疏水集团，和蛋白质的疏水区有较大的亲和力，和凝胶基质的亲和力不如氨基黑，所以用考马斯亮蓝染色是漂洗要容易的多。 原理：考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比。 蛋白质的定量测定 常量凯氏定氮法 原理：样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。 ①用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。 ②也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸。 消化 总反应式： 2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4（98%）=(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O 浓H2SO4脱水性： 有机物脱水被炭化→C、H、N 浓H2SO4氧化性： 2H2SO4+C=2SO2+2H2O+CO2↑ SO2+N(含氮化合物)→ NH3+ SO3 　　　　　　　　　 SO3+H2O=H2SO4 NH3+H2SO4=（NH4）2SO4 蒸馏 消化完全样品+NaOH 40% →碱性→加热蒸馏→NH3↑ 2NaOH+(NH4)2SO4=2NH3↑+Na2SO4+2H2O 3. 吸收与滴定 1)用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂,甲基红-溴甲基酚绿混合指示剂）或者用亚甲基兰+甲基红(国标) 指示剂 红色 绿色 红色 （酸） （碱） （酸） 2) 用过量的 H2SO4 或 HCl 标准溶液吸收，再用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂。 催化剂的功能 ①K2SO4：可以提高溶液的沸点而加快有机物分解。它与H2SO4作用生成KHSO4可提高反应温度340℃→400℃ K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3 K2SO4加入量不能太大，以防造成体系温度过高，又引起已生成铵盐分解，放出NH3↑ （NH4）2SO4→NH3↑+（NH4）HSO4 2（NH4）HSO4→2NH3↑+2SO3↑+2H2O 也可用Na2SO4或KCl代替,但效果不及K2SO4。 ② CuSO4 2 CuSO4→CuSO4+SO2↑+O2 C+2 CuSO4→Cu2SO4+SO2↑+CO2 Cu2SO4+H2SO4→2Cu2SO4+SO2↑+2H2O 消化完全后，不再有 Cu2SO4生成（褐色）→蓝绿色 CuSO4还可作消化终点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂 另外还可以加氧化汞、汞(均有毒，价格贵)、硒粉、二氧化钛等。 ③氧化剂： 如双氧水、次氯酸钾等，目的加速有机 物氧化速度 步骤：消化—蒸馏—吸收—滴定 注意事项 ①所用试剂应用无氨蒸馏水配制。 ②消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘附壁上造成消化不完全，损失氮。 ③消化过程中应注意不时转动瓶凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在壁上残渣洗下，并促进消化完全。 ④样品中若含脂肪 或 糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫小火加热，或加少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂；注意控制热源强度。 ⑤样品消化液不易澄清时，可加30%H2O22~3ml消化 ⑥一般消化至透明后，继续30min ,即可，但含特别难以氨化的氮化合物样品，如：赖氨酸，组氨酸、色氨酸、酪氨酸，需延长时间、有机物消化完全呈蓝色的浅绿色，但含Fe高时，呈较深绿色。 ⑦蒸馏前给水蒸汽发出器内装水至2/3容积处，甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升使其始终保持酸性，这样可以逸避免水中NH3被蒸发而影响结果。 ⑧2%硼酸吸收液每次用量10ml用前加入甲基红一溴甲酚绿混合指示剂2d。 ⑨蒸馏时，蒸气发生要均匀充足，蒸馏过程不得停火断汽，否则将发生倒吸。蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源．否则可能造成吸收液倒吸。 ⑩加碱要足，操作要迅速，漏斗应采用水封，以免NH3由此逸出。 ⑾混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。 ⑿蒸馏装置不能漏气。 ⒀若取样量较大，如干试样超过