CML患者骨髓间质干细胞的干细胞因子mRNA表达水平检测.pdfVIP

1 6 临床检验杂志2008年第26卷第1期 Chinese Journal of Clinical Laboratory Science，2008，Vo1．26，No．1 文章编号：1001-764X(2008))01-0016434 中图分类号：R446．11 文献标识码：A · 实验研究 · CML患者骨髓间质干细胞的干细胞因子 mRNA表达 水平检测 余先球 ，陆益龙 ，巴荣 ，朱彦 ，罗呜 ，朱伟 ，许文荣 (1．江苏大学医学院，江苏镇江212001；2．江苏大学附属医院血 液科，江苏镇江212001；3．江苏大学医学技术学院，江苏镇江212013) 摘要：目的 研究慢性粒细胞白血病(CML)患者骨髓间质干细胞(MSCs)生长活性及干细胞因子(SCF)表达水平，探讨MSCs 在CML发病中的作用。方法 以慢性期CML患者为实验组，健康人为对照组，抽取骨髓液行MSCs体外培养，动态观察细胞 形态并进行计数、绘制生长曲线；取第3、4代MSCs提取总RNA，逆转录，real—time PCR法检测SCF mRNA表达水平。结果 慢性期CML患者骨髓MSCs生长活性较健康人无明显差别；实验组MSCs表达SCF mRNA水平较对照组明显高(P0．05)。 结论 CML患者骨髓MSCs异常表达SCF参与CML发病，对其检测有指导诊断意义。 关键词：慢性粒细胞白血病；问质干细胞；干细胞因子 慢性粒细胞白血病(CML)是常见的获得性骨 离液上层进行密度梯度离心，取中间单个核细胞层。 髓增殖性疾病之一。以骨髓间质干细胞(MSCs)为 PBS洗涤3次后按5×10 单个核细胞／cm 接种于 主的骨髓造血微环境对正常造血调控起重要作用， 25 cm 培养瓶中，每瓶含5 rIll完全DMEM培养液 干细胞因子(stem cell factor，SCF)与白血病细胞增 (DMEM培养液中含青、链霉素100 U(100 Ixg)／ml， 殖、分化、聚集密切相关。MSCs通过SCF对白血病 100 ml／L胎牛血清，50 ml／L马血清，0．25 g／ml两 细胞增殖、分化发挥作用目前尚无定论。本研究比 性霉素)。置5％CO，、饱和湿度、37℃培养箱培养。 较 CML患者与健康人 MSCs生长特性及 SCF的 待MSCs贴壁生长，于3 d后换液，去非贴壁细胞此 mRNA表达水平，以探讨MSCs在CML发病中作用。 后每3 d换液1次，并在倒置显微镜下观察细胞形 1 材料和方法 态。培养10 d左右，贴壁细胞融合，用2．5 L胰蛋 1．1 研究对象 CML患者均为我院血液内科2006 白酶(用1 mmol／L EDTA—Na：配制)消化，按1：2的 年12月～2007年8月门诊及住院患者，参照FAB 比例接种传代。 诊断标准及WHO分型，经骨髓细胞形态学、免疫表 1．4 细胞动力学检测 取生长状态良好的细胞，消 型、分子生物学、细胞遗传学等检测确诊的5例 化成单细胞悬液，实验组、对照组MSCs浓度为5× CML慢性期患者为实验组，男3例，女2例，中位年 10 ／L，种植于24孔板，在相同条件下培养，每24 h 龄53．6岁。5例健康人为对照组，男3名，女2名， 取出计数2孔的均值，以培养时间为横坐标，细胞数 中位年龄45．7岁。 量为纵坐标绘制MSCs的1～11 d细胞生长曲线。 1．2 试剂和仪器 L—DMEM(Gibco BRL)、RNA提 1．5 总RNA提取及cDNA合成 当细胞铺满整个 取试剂盒(Invitrogen公司)、real—time PCR试剂盒、 培养瓶时(细胞数约为5～7．5×10 )，加Trizol(In— 逆转录试剂盒(Toyobo公司)、PCR试剂盒(Taka— vitrogen公司)裂解细胞，经氯仿、异丙醇提取总mR— ra)、倒置式生物显微镜(TE300，Nikon)、凝胶成像 NA并根据逆转录试剂盒操作说明按20 l体系合 分析系统(Syngene Bio Imaging Systtems)、PCR分析 成cDNA。 仪、Eppendof Biophoto