miR-20b直接靶向3′-UTR负性调节VEGF的表达.pdfVIP

第 45卷第 1期第 22页 华 中科技大学学报 (医学版) Vo1．45 No．1 P．22 2016年 2月 ActaMedUnivSciTechnolHuazhong Feb． 2016 miR一20b直接靶 向3-UTR负性调节 VEGF的表达* 陶象男 ， 汪忆梦 ， 宋传旺 蚌埠医学院第二附属医院检验科 ，蚌埠 233040 蚌埠医学院免疫学教研室，安徽省感染与免疫重点实验室，蚌埠 233030 摘要 ：目的 探讨 miR一2ob是否直接靶 向VEGF3-非编码 区(3-UTR)而调控其表达 。方法 采用 miRanda软件 预测 VEGF3-UTR是否存在 miR一2ob的结合位点 ；使用 PCR方法扩增 RAW264．7细胞 VEGF基 因3-UTR序列，经 双酶切后克隆到 pmiR～RB-Report 质粒海 肾荧光素酶的下游 ，得到 pmiR-RB-ReportMT-VEGF3-UTR双荧光素酶重组 质粒 ，使用 电泳法和测序法进行验证 ；将重组质粒或空质粒与 miR一2ob模拟物或其对照共转染 HeLa细胞 ，24h后检测 相应荧光素酶活性。结果 VEGF3-UTR存在miR-20b的结合位点；获得了含 VEGF3r_UTR的双荧光素酶报告载 体 ；重组质粒与 miR-20b模拟物共转染组 HeLa细胞的荧光素酶活性 明显低于空质粒转染组 (PO．05)。结论 成功构 建小 鼠VEGF基 因3，_UTR双荧光素酶报告载体 ，miR-20b可 以直接靶 向VEGF3～UTR而负性调控其表达。 关键词 ：血管 内皮生长因子 ； 3-非编码 区； miR-20b； 双荧光素酶报告载体 中图分类号 ：R392．3 DOI：10．3870／j．issn．1672—0741．2016．01．005 m iR一20bDirectlyTargets3一untranslatedRegionofVEGF and NegativelyRegulatesItsExpression TaoXiangnan ，W angYimeng ，SongChuanwang△ DepartmentofClinicalLaboratory，TheSecondAffiliatedHospitalofBengbu M edicalCollege，Bengbu233040，China DepartmentofImmunology，AnhuiProvincialKeyLaboratoryofInfectionand Immunity，BengbuM edicalCollege，Bengbu233030，China Abstract Objective ToinvestigatewhethermiR一20bdirectlytargetsVEGF3一untranslatedregion(3一UTR)andregu— laresitsexpression．Methods M iRandasoftwarewasusedtopredict,thebindingsitesofmiR_20btoVEGF 3-UTR．3一UTR sequenceofVEGFgenewasamplifiedusingpolymerasechainreaction(PCR)inRAW 264．7cells．PCR productswereclonedin— tothedownstream ofRenilla1uciferaseinpmiR-RB-Report plasmidtoobtainpmiR—RB-ReportTM_VEGF3一UTR recombinant vector．Electr0Dh0resisandDNA sequencingmethodsw