提取Ecoli基因组DNA.docVIP

革兰阴性杆菌，如E.coli，一般有三种可以选择的方法。一、水煮模板法—— 1、接种单菌落于LB或脑心平板，连续画线，37摄氏度培养18－24小时。2、刮取1～2接种环菌苔加入150微升三蒸水中，混匀，100摄氏度煮沸10分钟。3、12000转/分钟 离心10分钟，取上清，－20摄氏度保存备用。方法一法操作最简便，对试剂条件要求低。缺点是纯度不够高，可能会含有RNA、蛋白等杂质。但是作为一般检测目的的PCR反应模板已经足够了。若要提基因组水煮法基本不可行。因为基因组较大，易断裂！只不过做小一点的可以，1.0KB左右！我做过一次4.0KB的，必须提基因组！另外，提基因组最好要将枪头尖剪掉。以免枪头损伤基因组！抽干时最好是风干！二、1.5ml对数期菌液12000rpm 30 s200ul裂解液，37c,1hr66ul 5M NaCL,混匀充分，12000rpm 10min上清用粗枪头取至新管等体积酚充分混匀，12000rpm 3min，反复抽提至无蛋白层取水层，等体积氯仿混匀，12000rpm 3min上清至新管，2倍体积预冷无水乙醇-20C，20min，14000rpm， 15min400ul 70%冷乙醇洗涤干燥，100ul 20ug/ml RNaseA，37C，30min2倍体积无水乙醇沉淀，70%冷乙醇洗涤干燥，溶于100ul TE 方法二操作稍微复杂一些，但是得到的模板纯度较高，酚/氯仿抽提这一步如果操作得好的话，可以出去大部分蛋白杂质。如果在使用酚/氯仿之前加入RNase处理这一步的话，还可以除去其中的RNA杂质。三、使用试剂盒。方法三的原理主要是使用树脂、硅基质材料做成的离心吸附柱对原料进行层析过柱，最后得到纯化的DNA。优点是得到的模板纯度高，操作简单。缺点是成本较高。四、Chromosomal DNA IsolationMETHOD:Grow cells in 2-5 ml broth to late log phase.Pellet 1-2 ml cells in microfuge.Resuspend cells in 400 μl TES (50 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 10 mM EDTA, pH7.5).Add: 17 μl 30% (w/v) sarkosyl (final concentration of 1%) and 5 μl 10 mg/ml proteinase K (final concentration 100 μg/ml).Incubate at 37oC for 30-60 minutes, or until the solution clears.Add 400 μl 4 M NH4OAc and mix well.Extract 2X with 1:1 phenol:chloroform.Extract 1X with chloroform.Precipitate with an equal volume of isopropanol at RT for 10 minutes.Resuspend pellet in 400 μl 0.1 M NaOAc pH 6.0. Pellet may not resuspend completely. Reprecipitate DNA with 800 μl EtOH for 15 minutes at RT.Centrifuge at 11K for 15 minutes to pellet DNA.Rinse pellet in 1 ml 70% EtOH for 5 minutes.Dry pellet by placing open tube in 37C incubator or on bench top for 15-20 minutes.Resuspend DNA in 50 ul TE (10 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA) overnight at 4C. May add 1 μl RNase to help DNA dissolve. Yields 25-50 ug of DNA; use 1-5 μl per digest. TES:5.0 ml 1 M Tris pH 7.50.2 ml 5 M NaCl2.0 ml 0.5 M EDTA93 ml sterile MQ water  五、CTAB法：细菌培养及菌体收集　接种一单菌落于5mlLB中,30培养过夜,取1ml种子培养液接入100ml2%LB中,37、220r/min培养