植物DNA提取方法.docVIP

1.2实验方法 1.2.1 茶花基因组DNA的提取 采用CTAB法[8]提取DNA，所有试剂（有机溶剂除外）和器皿都经高压灭菌，主要步骤如下： （1）取两片幼嫩新鲜叶片，置于预冷的研钵中，倒入适量液氮，迅速研磨成粉末状，随后加入3ml预热的2%CTAB抽提缓冲液和50ul抗氧化剂2-巯基乙醇，继续研磨成略有流动性的糊状或粥状，转入1.5ml的离心管中，于65℃水浴锅中保温约60min. (2)待混合物冷却至室温后加入等600ul的CI（氯仿：异戊醇=24：1）溶液混匀，轻轻颠倒离心管几次使管内混合物成乳浊液，常温下10000rpm离心10min,取上清液转入另一干净的离心管中。 （3）重复步骤（2）一次。 （4）取步骤（3）上清液加入2.5倍体积无水乙醇，仔细混匀，-20冰箱30min以上，沉淀DNA 4℃，12000rpm离心10min. (5)弃去上层有机溶剂，加500ul75%乙醇洗涤沉淀，4℃下8000rpm离心5min,弃去上清，洗涤沉淀3次。 （6）倒置或者37度培养箱烘干. (7)加50ulTE缓冲液溶解DNA，于-20℃冷藏备用。 1.2.2 DNA含量和质量的测定 （1）紫外分光光度法：取4ml提取的DNA，将之稀释200倍，测定提取的DNA在260nm和280nm处的吸光度值，得出OD260/280的值以及DNA和蛋白质浓度。如蛋白质浓度过高，需纯化。 （2）琼脂糖凝胶电泳：配制1.0%琼脂糖凝胶，在0.5×TBE缓冲液中，电压5V/cm电泳约60min，溴化乙锭染色20min,在凝胶成像系统上观察并拍照。 1.2.3 PCR扩增 (1)PCR反应在Biometro PCR仪上进行，反应体系为25ul:ddH2O 14ul,10×Buffer 2.5ul,MgCl(25mM) 2.5ul,dNTPs(2.5mM) 2.0ul,primer(2.0uM) 1.0ul,DNA 2.7ul(约40-60ng),Taq酶（5U/ul） 0.3ul. ddH2O 13.7uL 10×buffer 2.5 uL dNTPs 2.0 uL MgCl2 2.5 uL Primer 2.0 uL DNA 2.7 uL (40-60ng) Taq酶 0.3 uL 共25 uL (2)反应程序为：94℃预变性3min;94℃变性30s,36℃退火1min,72℃延伸1min30s,40次循环；72℃最终延伸10min;4℃保存。 预94℃ 3 min 变性94℃ 30 s 退火36℃ 1min 40个循环延伸72℃ 1min30s 继续延伸 72℃ 10 min 保 存 4℃ 1.2.4 PCR扩增产物检测 取扩增产物与6×loading buffer混匀，在1.3%的琼脂糖凝胶上电泳，缓冲液为0.5×TBE,电压5V/cm,电泳1.5-2h.经溴化乙锭染色20min后,取出凝胶在成像系统中拍照并保存结果。 1.3数据处理及RAPD分析 得出清晰，亮度较好的条带后，用laberworkers软件分析所得条带，在同一位点重复出现条带的记为“1”（包括弱带），不出现条带的记为“0” [9]，并分析扩增条带的长度。将生成的数据输入电子表格，用NTSYSpc21软件分析得出据类图和遗传相似系数和遗传距离。其中相似系数[10]为: s= [ 2M xy/(M x + M y ) ] ×100% (s表示相似系数,M xy 表示品种x、y 共有片段总和,M x 表示x 品种片段数,M y 表示y 品种片段数) ,遗传距离Ｄ＝１-Ｆ。 2 结果与分析 2.1 基因组DNA提取 提取的DNA经分光光度计测定，其OD260/280,DNA含量如下： 表2 基因组DNAOD260/280,DNA含量。 Table2 Results of DNA extraction from leaves of 15 Camellia samples __________________________________________________