流式细胞术临床检测项目操作流程.docVIP

临床检测项目操作流程 1：淋巴细胞亚群测定 2：HLA-B27测定 3：CD55／CD59测定 4：血小板抗体测定 5：红细胞抗体测定 6：粒细胞抗体测定???? 7：白血病免疫分型测定 8：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定 9：XL操作步骤 淋巴细胞亚群测定 (CD系列) 方法???? ?? 流式细胞仪() 原理：???? 双/三色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数。淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+；B淋巴细胞：CD5+，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8+；NK细胞：CD3-CDl6+56+等。根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数。标本采集与处理?受检者的准备?检查对象生活饮食处于日常状态，空腹静脉采血。 抗凝剂EDTA或肝素抗凝血???? 要求?1．样本量至少1ml。?? ????????????2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。 ????????????3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若10.0×109/L，??样本需要稀释，用PBS稀释；若4.0×109/L，应分离单个核细胞。 ????????????4．溶血样本不能用。试剂 ??????品牌?????????????? 规格????贮存 ??????贝克曼库尔特 成分??1：单克隆抗体????????1ML???? 2—8℃ ?????? 2：全血溶血试剂???? ????????????A：甲酸??????????70ML???? 室温 ????????????B：碳酸钠等??????32ML???? 室温 ????????????C：多聚甲醛????14ML???? 室温 ??????3：鞘液?????????????20L?????? 室温 ??????4：清洗液????????????5L?????? 室温 ??????5：荧光微球????????????10ML???? 2-8℃???? 质控品产品，未开瓶的试剂于2-8保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。样本制备：?? 1) 按照要求，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照 2) 分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。 3) 混匀，避光，室温孵育20-30分钟4) 溶血：FACS LYSING SOLUTION (按说明书步骤溶血)5) 上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样操作性能 ?? 精密度????批内五次重复CV2％???? ?? 灵敏度????500—1000个荧光素分子????参考值(百分数（绝对值）) ?? CD3+??60.8-75.4%(1141-1880)????CD4+??29.4-45.8%(478-1072) ?? CD8+??18.2-32.8%(393-742)??????NK???9.5-23.5%??(175-567) ?? Th/Ts??1.05-2.03临床意义 1.T、B淋巴细胞亚群是重要的免疫状态检测指标，在肿瘤、免疫缺陷、病毒感染，自身免疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等具有临床诊断、病情判断、治疗等价值。临床常用ThTs比值来判断病人的免疫状况。Th／Ts比值升高： 表示免疫功能亢进：见于自身免疫性疾病，如SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力以及HBsAg+乙肝等。 Th／Ts比值减低：表示免疫功能下降：艾滋病、病毒感染、肿瘤病人、慢活肝和活动性肝硬化、再生障碍性贫血、粒细胞减少患者。 2：NK细胞主要破坏各种肿瘤细胞和感染某些病毒、细菌的细胞，所以在抗肿瘤和防御疾病中起主要作用。NK活性减低主要见于各种恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、应用免疫抑制剂，疲劳综合征病人等，NK活性随年龄增长而减退。NK细胞也参与第二型超敏反应和移植物抗宿反应，白介素-2治疗后；外周血NK细胞增加。HLA-B27测定 原理：?? 双色直接免疫荧光法。将HLA-B27-FITC/B7-PE单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗体结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，测定HLA-B7阴性而HLA-B27阳性细胞的平均荧光强度和所占的百分比。??样本制备：?? 1) 按照要求，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆