免疫诊断概述及操作.docVIP

免疫诊断概述与操作 (Immune Diagnosis) 长期以来，国内外对微生物标本的检测方法，尽管作了不少的改进和发展，但基本上还是从纯培养的观念出发，应用各种培养基，进行分离培养、形态检查、生化反应和动物试验等，尽管解决了不少问题，但它既浪费人力、物力，而且需要2～3天，甚至更长的时间才能报告结果，以至失去了对临床工作的指导意义，从而不同程度地影响着它的使用价值。 为此，国内外许多从事这方面工作的人员，都颇为重视应用免疫学技术、分析微生物学技术和分子遗传学技术与微型计算机相结合，对细菌等各类微生物标本进行检验的研究。这样在检测标本的过程中，既无需进行分离微生物或作纯培养，也不需要作生化试验等，而是应用上述技术对标本直接做检测，以确定在标本内是否含有活细菌、细菌产物，或抗原成分的存在，定性并定量，而且在2～3小时左右即可报告检验结果，以达到对患病后的畜禽呈现的异常表现及突然死亡的原因，及时作出确切的实验室诊断，或对治疗效果作出合理的评价。免疫学技术除用于传染病的诊断外，还可用于自身免疫病、免疫缺陷病、超敏反应性疾病等与免疫有关疾病的诊断、发病机理、病情监测及疗效评价等方面。 目前为大家所瞩目的用于检测的免疫学技术，主要包括免疫酶技术、放射免疫技术、免疫荧光技术、免疫微载体技术及淋巴细胞类型鉴定技术等。另外，本章也将对微生物学和免疫学领域有很大使用价值的分析微生物学技术，如电阻抗技术、微量热力学技术、生物光及化学光技术、气相色谱技术、生物传感技术，以及分子遗传学技术如核酸探针技术、质粒图谱分析法、染色质DNA酶切图谱分析法、生物芯片技术及聚合酶链反应等技术的基本原理和应用等方面也顺便在此分别作介绍，但基本上不涉及具体的操作方法。 一、 酶联免疫吸附试验 酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immune sorbent assay, ELISA)是Engvall和Van weemen于1971年提出的。该法是以固相载体吸附技术和免疫酶技术相结合建立的一种检测方法，其操作简便，无需特殊设备，并具有高度的敏感性和准确性，所以受到大家的广泛重视，以致在较短时间内，于国内外均取得了较快的进展。 (一) 主要的技术类型 ELISA的技术类型很多，但以检测抗体的间接法，及测定抗原的双抗体夹心法最常用，现将其操作流程分别简介如下。 1. 间接法首先将已知标准抗原吸附在聚苯乙烯塑料反应板的相应孔中，然后加入被检血清，在温箱中作用一定时间，使形成的抗原抗体复合物均匀地附着在固相载体上，再滴加用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗免疫球蛋白，则与固相载体上的抗原抗体复合物的抗体结合，当加入底物溶液时，H2O2在酶的催化下氧化，同时使无色的显色剂邻苯二胺(OPD)脱氢氧化，形成可溶性的氧化型棕色联苯胺，产生的颜色强度的差别，可用肉眼或特制的72型分光光度计检测，由此推算出被检血清中是否有相应抗体，以及含量的多少。 2. 双抗体夹心法首先将已知抗体球蛋白吸附在载体上，致敏后，冲洗除去多余抗体，滴加被测抗原，致敏后，冲去过剩抗原，滴加酶标抗体，室温下致敏后，冲洗除去过剩的标记抗体，加入底物溶液显色后，再加入终止剂，以终止反应的进行，最后根据反应孔中颜色的深浅，对被检抗原作出检定。 (二) 在微生物检测方面的应用 ELISA技术问世以来，已广泛用于各种病原微生物，如病毒、细菌、真菌、支原体、立克次氏体、衣原体、螺旋体等及其抗体的检测，在微生物检测和疾病诊断方面发挥了重要作用，通过试剂和检测方法的标准化，组装的ELISA诊断试剂盒，已在临床上得到了广泛的应用。 (三) ELISA的特点 灵敏度高，检测能力可达10-6mg/ml水平；应用范围广，既能检测抗原又能检测抗体，既能定性又能定量；有效期长，酶标抗体于普通冰箱中可保存一年以上，效价不下降，制成的标本，可长久保存，供随时复查用。 ［附］： 免疫酶染色法(组化法) 该法的原理与免疫荧光法相似，不同之处在于用酶标记的抗体，称酶标抗体。酶标抗体与抗原发生特异性结合，当加入酶的底物时，底物在酶的催化下，发生组织化学反应，产生有色物质，该物质不需特殊仪器，在光学显微镜下即能观察，目前常用的酶是HRP，底物为DAB，可生成棕褐色沉淀物，使玻片组织标本上的抗原所在部位呈现颜色。 二、 BAS-酶联免疫吸附试验 BAS-酶联免疫吸附试验(BAS-ELISA)是ELISA的一种改良技术，将BAS，即生物素-亲和素系统(biotinavidin system)引入ELISA，大大提高了ELISA的灵敏度。 (一) 亲和素和生物素 1. 亲和素(avidin) 给动物饲喂大量卵白蛋白后，可引起生物素缺乏症，此后证明，卵白蛋白中存在一种对生物素有异常亲和力的碱性蛋白，称之为抗生物