PCR产物不经过酶切,直接快速,定向克隆入任何载体的方法.docVIP

PCR产物不经过酶切，直接快速，定向克隆入任何载体的方法 默认分类 2010-08-13 23:15:45 阅读260 评论0 ??字号：大中小?订阅 EZfusion PCR定向克隆同源重组试剂盒，专门为把PCR产物快速，定向，有效的克隆到任何目标载体而设计。有效的避免了在克隆过程中遇到的合适内切酶的选择，磷酸化，补平，加A，使用中间载体等等一系列复杂步骤。无需连接酶，只需要把目标载体线性化(平末端，粘性末端都可以)，PCR产物无需任何酶促处理，直接和目标载体混合，20-30分钟一站式解决所有问题。 ? 技术原理：根据酶切后线性化载体的两端序列，分别在目的基因两端设计15 base与载体末端同源的序列，PCR扩增的产物两端就会分别带有15 bp与线性化载体两端相同的序列。PCR产物和线性化载体与EZfusion Enzyme酶充分混匀，22 ℃温浴30 min后，按传统方法转化E. coli competent cells，就可以高效、定向地将PCR产物克隆到目标载体上。如下图： ? ? 适用范围： 1、PCR cloning into any vector 2、Long PCR DNA (up to 12 kb) cloning 3、Gene transfer from one vector to another 4、High-throughput (HTP) PCR cloning 5、In vitro joining of DNA fragments ? 优点： 1适用于各种自备载体、插入片断、或者酶切位点，只要线性化载体就行（单酶切、双酶切均可），不用酶切PCR产物，不用补平或加A处理，不用去磷酸化载体，不用连接 ； 2. 适用于各种PCR酶（常规Taq、各种高保真酶均可）的扩增产物 ； 3. 混合温育30 4. 精确定向克隆，即使载体单酶切也可以定向，表达产物没有多余的氨基酸 ； 5. 重组效率高、转化率高，可用于高通量操作，批量克隆, 重复性高、可靠性好； 6. 根据实验需要选择适合的表达载体，选择最佳酶切位点，酶切载体后得到线性化载体（单酶切或者双酶切均可），得到PCR产物和线性化载体后，加入EZfusion Enzyme酶，混合，22°C保温30分钟后转化，就可以高效、精确、定向将PCR产物克隆到目标载体上。 ? 操作步骤： A.PCR引物设计以及片段的准备： 用该试剂盒克隆目的基因或者目标DNA片段到指定的线性化载体，PCR扩增所用的引物的最外侧必须有10-18个碱基与线性载体最外侧完全配对。现就15个碱基配对举例如下： 注意: 捷瑞公司的引物设计与BD In-Fusion Kits是不同的. 使用捷瑞公司的试剂盒, 仅使用上游10-18个碱基和下游10-18个碱基作为附加碱基即可。 ? 可以采用任何聚合酶来得到PCR产物，但是，引物和引物二聚体会对EZfusion 有一定的抑制作用。如果PCR反应得到单一的目的条带，PCR产物可以用PCR纯化试剂盒回收，比如捷瑞公司的PCR产物回收试剂盒（GK2051）;如果PCR产生很多非特异性条带，应该用凝胶回收纯化目的条带，比如捷瑞公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（GK2041）去除掉多余条带。 ? B．线性载体的制备： 克隆载体的完全线性化对于重组克隆至关重要。没有线性化的载体会产生非常高的背景。线性化载体需要过柱纯化或者电泳回收。 ? C.???? 同源重组反应体系的建立; ? Linearized vector (100-200 ng/μl) 6 μl Purified PCR products (100-200 ng/μl) X μl 5X EZfusion Buffer 4 μl EZfusion Enzyme 0.5 μl Deionized water Y μl Total volume 20 μl ? 一般来讲，加入更多的PCR产物有助于筛选出更多目的克隆。比如，加10 μl of PCR DNA (X = 10) 将得到 95%有效克隆。对于短链的PCR产物，可以相应减少DNA的体积。不同长度的 PCR DNA 片段，请按照如下的体系添加PCR产物。 PCR DNA of 1 kb X = 4 PCR DNA of 2 kb X= 6 PCR DNA of 3 kb X= 8 PCR DNA of 3 kb X=10 ? 1.???????? 22°C或室温（25℃）放置 30 分钟, 冰上放置5-20分钟。 2.???????? 立即转化或者-20℃冻存，稍后转化。 ? D. 转化 1.?????? 新鲜制备的或-70℃下保存的100(l感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻地将细胞均匀悬浮。 2.????