sod含量的测定.docVIP

学院 园艺学院 姓名 田蓉 学号2012050363 实验题目 SOD活性测定 原理 超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2.－，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替 （ 黄 色 ） ，继而还原生成二甲月替 ，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替 生成速度减慢。 本实验依据SOD抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。 实验材料、主要仪器和试剂 1．实验材料 正常生长的和低温处理的小麦叶片。 2．主要仪器 （1）可见分光光度计。 （2）万分之一分析天平。 （3）高速冷冻离心机。 （4）－40℃冰箱。 （5）荧光灯。 （6）研钵。 （7）离心管 5mL数个。 （8）恒温培养箱。 （9）移液管或加样器 0.5mL×4；1mL×2；2mL×2；5mL×1。 （10）容量瓶 50mL×1；100mL×5；250mL×1；1 000mL×2。 3．试剂 （1）50mmol/L pH7.8磷酸钠（Na2HPO4-NaH2PO4）缓冲液。 （2）130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液。 （3）7.5 × 10－4 mol/L NBT溶液。 （4） 2 × 10－5 mol/L核黄素溶液。 （5）1 × 10－4mol/L EDTA-Na2溶液。 （6）0.05 mol/L pH7.8磷酸钠缓冲液 方法 1．SOD的提取： 称取植物材料0.5g于预冷研钵中，加2ml预冷的提取介质在冰浴中研磨匀浆，转至10ml容量瓶中，用提取介质冲洗研钵2~3次，合并冲洗液于容量瓶，定容至10ml。取5ml提取液于4℃1000 r/min（10 000g）冷冻离心15min，上清液即为SOD酶粗提液。 2．酶活力的测定 取透明度好，质地相同的试管7支，测定管和光下对照管各3支，暗中对照（调零）1支，按下表加显色试剂。 表1 SOD活性测定反应系统 反应试剂/ml 正常 低温处理 光下对照 暗对照 1 2 1 2 1 2 7 50mmol/L 磷酸钠缓冲液 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 130mmol/L 甲硫氨酸溶液 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 7.5 × 10－4 mol/L NBT溶液 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 1 × 10－4mol/L EDTA-Na2 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 2 × 10－5 mol/L核黄素溶液 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 粗酶液 0.1 0.1 0.1 0.1 0 0 0 蒸馏水 0.5 0.5 0.5 0.5 0.6 0.6 0.6 吸光度值（560nm） 0.797 0.657 0.498 0.345 1.107 1.003 0 给7号管加入核黄素后立即用双层黑色纸套遮光，全部试管在荧光灯下显色，反应15~20min。反应后用黑布遮盖试管终止实验，以暗中对照管作空白，在560mm下测定1~6号试管反应液的光密度，记录测定数据。 结果计算 已知SOD活性单位以抑制NBT光还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。SOD总活性＝ 式中：SOD总活性以每g样品鲜重的酶单位表示（U/g）；Ack 为照光对照管的吸光度；AE 为样品管的吸光度；V为样品液总体积(ml);Vt 为测定时样品用量(ml)；W为样鲜重(g)。 各管在560nm下吸光度值情况如表2所示 表2 吸光度情况 测定管 常温处理 冷冻处理 光下对照 重复1 重复2 重复1 重复2 重复1 重复2 A560 0．797 0.657 0.496 0.345 1.107 1.003 0.727 0.421 1.055 根据表2中的吸光度情况可以分别计算出常温和冷冻处理的SOD总活性。 常温